Studii Clinice


Prezentari de cazuri  ale unor pacienti cu boala canceroasa si metastaze hepatice tratati cu preparate standardizate din plante cu proprietati imunomodulatorii

Introducere

Prognosticul pacientilor cu carcinom hepatocelular primar sau metastatic este corelat in mod defavorabil cu icterul, ciroza si cu metastazele de la nivelul altor organe.Supravietuirea medie este, de cele mai multe ori, foarte scurta (4-6 luni). Procedurile chirurgicale, necesitand in general lobectomii ori segmentectomii,sunt asociate cu ameliorari considerabile ale ratei de supravietuire.Totusi,majoritatea pacientilor cu carcinom hepatocelular nu sunt eligibili chirurgical din cauza caracterului multifocal tumoral ori a afectarii severe a functiei hepatice astfel incat rezectiile hepatice la asemenea cazuri nu ofera beneficii pe termen lung.

In consecinta, acest tip de pacienti sunt tratati in special prin chimioterapie care, uneori, este in masura sa induca diminuari ale marimii tumorilor macroscopice.

Totusi, chimioterapia reuseste rareori sa produca disparitia completa a acestor tumori, iar durata raspunsului este scurta.

In ultimele decade, o atentie speciala a fost acordata rolului dezechilibrului imun in raport cu prognosticul rezervat al tumorilor metastatice.

In acest articol sunt prezentate cateva cazuri de pacienti cu diverse suferinte oncologice metastazate hepatic, si care au fost tratati cu preparate standardizate din plante cu proprietati imunomodulatoare, in asociere cu terapii oncologice conventionale.

Toti pacientii inclusi in studiu au primit extract de vasc (EV) standardizat pentru lecitinele din vasc (LV), administrate in doze adecvate-dovedite a produce maximul de efect favorabil asupra dezordinilor generate de cancer in privinta echilibrului imun.

Asociate tratamentului cu EV, s-au administrat alte doua preparate standardizate din extracte vegetale, cu efecte imunomodulatoare: un preparat heteropolizaharidic din tarate de orez , standardizat pentru arabinoxylan (Biobran/MGN-3) si un extract fermentat din germeni de grau, standardizat pentru 2,6-dimetoxi-p-benzochinona (2,6-DMBQ) continuta de acesta (EGG/Avemar®).

Deoarece aceste tratamente imunomodulaoare combinate cu terapiile oncologice uzuale s-au materializat in mai multe remisiuni complete, importanta lor trebuie discutata.

Materiale și metode

Extractul de vasc (EV) si Standardizarea sa prin Enzyme Linked Lecitin Assay (ELLA)

Iscador® este un extract apos vegetal din vasc, procesat si furnizat de catre Weleda AG (CH-4144 Arlesheim, Switzerland).

Continutul activ (legat zaharic) de lecitina din extractele de vasc disponibile comercial a fost masurat in laboratoarele de cercetare ale Facultatii de Farmacochimie din cadrul Universitatii Medicale PECS.

Determinarea nivelului lecitinelor din vasc legate zaharic (LV) din EV a fost efectuata printr-o tehnica ELLA optimizata, descrisa anterior.

Pe scurt, metoda se bazeazape legarea lecitinei de un oligozaharid fixat (asialofetuin) si apoi fixarea de anticorpi policlonali specifici de lecitina legata. Legarea specifica a anticorpilor de sobolan a fost apreciata prin utilizarea de peroxidaza caprina anti-sobolan si prin colorarea cu un derivat de fenilendiamina clorhidrica. Lecitina standard a fost izolata din plante proaspete, utilizandu-se cromatografia de afinitate, apoi a fost liofilizat conform descrierilor anterioare.

Dozele de preparate standardizate din etract de vasc

Raspunsurile celulare ale sistemului imunitar innascut al unui lot de soricei Balb/c si al unor voluntari sanatosi, induse prin administrare de EV, au fost investigate repetat.EV standardizat a prezentat un model,,in forma de clopot''in privinta relatiei doza-raspuns iar dozele de lecitina cuprinse intre 0,5-1ng/kg s-au dovedit a fi cele mai eficiente, dupa cum s-a confirmat ulterior pe voluntari sanatosi. Intrucat 2-3 zile de pauza terapeutica s-au dovedit a fi necesare pentru obtinerea unui efect imunologic optim, injectiile subcutanate cu EV s-au administrat de doua ori pe saptamana,cu regularitate.Consecutiv, dozele de lecitina administrate pacientilor au fost orientate dupa acest model.

Dozele de extract standardizat din taratele de orez (Biobran/MGN-3)

Al doilea imunomodulator folosit in tratamentul combinativ al pacientilor prezentati este BioBran/MGN-3, care este produs si furnizat de catre Daiwa Pharmaceutical Co.Ltd.,Tokyo,Japan. Acest produs este compus dintr-o hemiceluloza denaturata, obtinuta din taratele de orez si apoi expusa la actiunea unei multimi de enzime carbohidrat-hidrolitice provenite din ciupercile shiitake. BioBran/MGN-3 este standardizat pentru compusul ei chimic principal : arabinoxylan, cu o xyloza ca si catena principala si cu un polimer de arabinoza in catena laterala.Pacientilor li s-a administrat oral BioBran/MGN-3 in doze cuprinse intre 12-45mg/kg, de doua ori pe saptamana, paralel cu terapia lecitinica optimizata.

Administrarea de extract fermentat din germeni de grau (EGG/Avemar®) 

EGG (denumit comercial Avemar®) este un complex de numeroase molecule biologic active obtinut din extractul fermentat de germeni de grau. Efectele sale biologice sunt legate de 2-metoxi-p-benzochinona(2-MBQ) si de 2,6-dimetoxi-p-benzochinona (2,6-DMBQ), glucosidate. In timpul fermentatiei, chinonele sunt eliberate prin actiunea enzimatica a glucozidazei produse de ciupercile de drojdie.

Tabletele de 1045mg sunt produse si furnizate de Biopharma Kft,Kunfeheherto,Hungary.

EGG este standardizat pentru continutul sau de 2,6-DMBQ (avand concentratia de 0,4mg/g din masa uscata).

Cazurilor prezentate li s-a administrat oral EGG in doze cuprinse intre 50 si 80mg/kg/zi, de patru ori pe saptamana (in ziua cu imunoterapie si in ziua urmatoare).

Criteriile de eligibilitate ale pacientilor cu metastaze hepatice

Criterii de includere:

1.tumora maligna demonstrata histologic;

2.pacienti non-necesitanti de nursing;

3.pacienti non-necesitanti de morfinice la intrarea in studiu.

Criterii de excludere:

1.lipsa examenului histologic;

2.indexul Karnofsky sub 60;

3.efecte secundare nedorite.(cum ar fi alergia).

Comitetul etic

Comitetul etic a propus observarea si publicarea cazurilor studiului, tratate cu EV avand standardizata activitatea lecitinica. Toti pacientii au acceptat in cunostinta de cauza procesarea si publicarea datelor personale. Aceste studii de caz pot stimula interesul altor grupuri de cercetare, in opinia comitetului etic.

REZULTATE

In Tabelul 1 sunt prezentati opt pacienti cu metastaze hepatice, listati cronologic.

CAZUL 1:  

Pacient de 72ani, cu melanom malign extirpat (IA SSM nivel Clark II,pT1 N0 M0,Breslow 0,375) de la nivelul bratului drept in1992 si, din cauza unui melanom nodular secundar (IIA,pT3 pN0 pM0) aparut pe umarul drept, o noua operatie a fost efectuata in 1999. In august 2001 au fost extirpati trei limfonoduli axilari drepti. In aceeasi perioada a fost detectat un nodul solitar metastatic la nivelul segmentelor 4/5. Din octombrie 2001 pacientului i s-a administrat tratament cu EV lecitin-standardizat. In iunie 2002 s-a evidentiat remisia completa a metastazei hepatice. Pana in 2012 nu s-a observat recurenta metastazei hepatice si functiile hepatice au fost normale. Calitatea vietii pacientului a fost apreciata ca excelenta.

CAZUL 2:

Pacienta de 59 ani, la noua ani dupa operatia de cancer al sanului stang sufera o recurenta locala multifocala extinsa, de tip carcinom ductal invaziv, operata in noiembrie 2011. Concomitent,au fost detectate ecografic metastaze hepatice multiple in lobul drept,de peste 35mm. In noiembrie 2011 s-a inceput tratamentul cu EV lecitin-standardizat, asociat cu BioBran/MGN 3 si EGG. Paralel cu aceasta imunomodulare s-a administrat o terapie anti-estrogenica (Femara,20mg/zi)

In ianuarie 2012, ecografia si PET-CT nu au detectat nici o metastaza hepatica. De asemenea functiile ficatului au fost normale. Urmatoarele controale, din iunie si noiembrie 2012, au reconfirmat completa remisie hepatica.

CAZUL 3:

Pacienta de 47ani la data prelucrarii studiului, a fost diagnosticata in martie 2009 cu cancer al sanului (cT4b cN3 M1), avand multiple metastaze hepatice (in segmentul 4a/b). Din aprilie 2009 pana in septembrie 2009, pacienta a efectuat sase cure de Epirubicin si Ciclofosfamida, plus hormonoterapie (Letrozol).

Concomitent, pacienta a fost tratata cu EV lecitin-standardizat.

Dupa o remisie partiala a metastazelor hepatice, in octombrie 2009 s-a efectuat ablatia sanului, urmata de iradiere cu 54 GY. Apoi pacienta a urmat doar hormonoterapie impreuna cu EV lecitin-standardizat,in iunie 2010 constatandu-se la PET-CT completa remisie a metastazelor hepatice. In iunie 2011, tot la examinarea PET-CT, s-a constatat reaparitia metstazelor hepatice, insa mai reduse. In aprilie 2012 pacientei i s-a aplicat TARE-terapia (tratament cu fascicul radioactiv superselectiv,respectiv pentru segmentele 1,2si 4a/b) .

In mai 2012 pacienta a fost reevaluata si considerata complet remisa, cu o excelenta calitate a vietii,putandu-si relua activitatile obisnuite.

CAZUL 4:

Pacienta in varsta de 66ani la data prelucrarii studiului, a suferit in august 2005 o operatie pentru carcinom ovarian (pT3c pN1 M0).

Dupa operatie, pacienta a urmat sase cure de Taxotere plus Carboplatin. In noiembrie 2007, la examinarea PET-CT au fost detectate metastaze hepatice multiple. Din noiembrie 2007 si pana in aprilie 2010, pacienta a urmat EV lecitin-standardizat impreuna cu chimioterapie (Caelix si Gemzar,apoi Xeloda si Uromitexan). Pe durata a 30 luni de observatie nu s-au constatat progresii ale bolii.

CAZUL 5:

Pacienta in varsta de 49ani la data prelucrarii studiului,avand carcinom mamar ductal (T2 N1 3/17 Mx), a efectuat tumorectomie in ianuarie 2010, apoi hormonoterapie (Femara) si chimioterapie (sase cure de Epirubicin cu Docetaxel). In aprilie 2011au fost evidentiate prin PET-CT multiple metastaze hepatice. In decembrie 2011 au fost indepartate chirurgical sapte metastaze hepatice. Sase saptamani mai tarziu,PET-CT a evidentiat o progresie considerabila a metastazelor hepatice. Din cauza disfunctiilor hepatice, a fost posibila doar mono-chimioterapia, si doar in doza redusa (Xeloda,2500si apoi 1500mg/zi)

Concomitent s-a inceput terapia imunomodulatoare cu EV lecitin-standardizat,BioBran MGN 3 si EGG. In aprilie 2012, la examenul CT s-a constatat o remisie considerabila a metastazelor hepatice-doar trei mici restante.

Functiile hepatice s-au normalizat. Din ianuarie 2012si pana in iulie 2012,markerii tumorali au scazut:antigenul carcinoembrionar (CEA) de la 36,1la2,95ng/ml si antigenul polipeptidic tisular (TPA) de la 232la 56,3U/.

Imbunatatirea rapida a functiilor hepatice este schitata in Figura 3. In august 2012 s-a constatat o cvasicompleta remisie a metastazelor hepatice (nemasurabile prin CT).  Calitatea vietii pacientei a devenit excelenta, fiind capabila sa isi reia 100% ocupatia.

CAZUL 6:

Pacient de 63 ani la data prelucrarii studiului, a suferit in noiembrie 2010 tumorectomia si limfadenectomia regionala pentru un carcinom de colon (Dukes C,T3 N1 3/5 M1) .

Concomitent, la examenul PET-CT au fost evidentiate multiple metastaze hepatice, retroperitoneale si ganglionare mezenterice .

Din decembrie 2010 pana in iulie 2011, pacientului i s-au administrat 12 cure FOLFIRI (Leukovorin+5-Fluoruracil) cu Avastin si Irinotecan.

In iulie 2011, examenul PET-CT a evidentiat o progresie a metastazelor hepatice si limfonodulare. Din august 2011 s-a inceput tratamentul imunomodulator, administrandu-se EV lecitin-standardizat, MGN-3/BioBran si EGG. In contiunuarea oncoterapiei, s-a administrat doar Avastin, in paralel cu tratamentul complementar. In octombrie 2011 nu s-au mai evidentiat metastaze hepatice sau limfonodulare la examenul  CT .

In noiembrie 2011 tratamentul imunomodulator a fost intrerupt si pacientul a decedat dupa o rapida progresie a bolii in septembrie 2012 .

CAZUL 7:

Pacienta de 54ani la data prelucrarii studiului, a suferit in iunie 2004 o hemicolectomie pentru un carcinom metastatic de sigmoid (pT4 pN1 13/35 M1) .

Dupa operatie a urmat sase cure FOLFOX (Oxaliplatin+Leukovorin+5-Fluoruracil)  in decembrie 2004 fiind supusa unei rezectii de segment hepatic .

Din august 2004 s-a instituit terapia cu EV lecitin-standardizat .

Pana la decesul sau din iulie 2008 nu s-au pus in evidenta recurente sau metastaze hepatice cu exceptia unei metastaze anexiale, operata in ianuarie 2007.

Pacienta a decedat ca urmare a noilor limfadenopatii si a metastazelor pulmonare .

CAZUL 8:

Pacient de 56 ani la data prelucrarii studiului, a fost operat in iulie 2009 pentru un carcinom de colon (pT4 N1 4/13 M1). In septembrie 2009 s-a efectuat o rezectie a metastazelor hepatice.

Apoi a urmat sapte cure FOLFIRI (Leukovorin+5-Fluoruracil)  si Avastin, in paralel cu administrarea de EV lecitin-standardizat. Examenul PET-CT din  mai 2011 nu a fost evidentiat metastaze hepatice.

Din cauza metastazelor limfonodulare voluminoase de la nivel mediastinal, abdominal si retroperitoneal, din mai 2011si pana in ianuarie 2012 s-au administrat unsprezece cure de FOLFOX (Oxaliplatin+Leukovorin+5-Fluoruracil).

Tot din mai 2011 s-a administrat tratamentul asociat  EV lecitin-standardizat, BioBran MGN 3 si EGG.

Examinarile CT din octombrie 2011, din ianuarie 2012 si din martie 2012 nu au detectat metastaze hepatice sau ganglionare, indicand o remisie aproape completa, insotita de o buna calitate a vietii.

Din cauza unor probleme financiare, incepand cu aprilie 2012, pacientul a oprit tratamentul imunomodulator.

DISCUTII

Aceste prezentari de caz sugereaza ca imunomodulatorii standardizati din plante (LV,EV,MGN-3,EGG) pot fi utili oncotratamentului metastazelor hepatice.

Combinarea acestor imunomodulatoare din plante cu tratamentele oncologice conventionale poate face posibile aceste remisiuni complete, rar intalnite in cazul oncoterapiilor standard ca atare. Asa cum se cunoaste, pacientii cu metastaze hepatice supusi chimioterapiei, rareori pot beneficia de o reducere a acestora mai mare de 50%, si aceasta doar pentru scurta vreme.

Cazul 1 reprezinta completa remisie a unei metastaze hepatice dupa administrare doar de EV lecitin-standardizat.

Pana la data prelucrarii datelor studiului, dupa 12 ani de observatie, pacientul nu a prezentat recurente tumorale si are o foarte buna calitate a vietii. Pe baza acestui rezultat s-a continuat tratarea si a altor pacienti cu metastaze hepatice.

Cazurile 2 si 3 reprezinta remisii ale metastazelor hepatice dupa terapia combinata dintre hormoni (anti-estrogenici) si imunomodulatoare.

Dupa cum se cunoaste, anti-estrogenii sunt capabili sa inhibe proliferarea celulelor mamare canceroase si, prin urmare, se poate extrapola ca efectul antitumoral al celulelor imune ar putea fi intensificat de aceasta terapie hormonala. Similar anti-estrogenilor, efectele antiproliferative ale citostatocelor par a sprijini  mecanismele imunologice antitumorale.

Cazul 4 poate sustine aceasta ipoteza din moment ce progresia metastazelor hepatice sub doze mari de chimioterapice a putut fi stopata doar dupa adaugarea de EV lecitn-standardizat, dar fara a se produce si o remisie.

Cazul 5 reprezinta o importanta si rapida remisie de metastaze hepatice, prin administrarea unor doze mici de mono-chimioterapie(Xeloda), in asociere cu imunomodulatori din plante (EV lecitin-standardizat, BioBran MGN 3 si EGG).  Aceste observatii sugereaza ipoteza ca , in anumite conditii, aceste tratamente imunomodulatoare combinate cu doze mici de chimioterapice pot fi mai eficiente decat combinarea lor cu doze mari de citostatice.

Cazul 6 arata cum o combinatie dintre Avastin (inhibitor al VEGFR) si aceste imunomodulatoare standardizate din plante pot induce, de asemenea, o remisie completa.

Tot in acest caz 6 se poate presupune ca, dupa un succes clinic, nu este recomandabil a opri aceste terapii imunomodulatoare, din moment ce, dupa o remisie completa, pacienta nu a continuat imunoterapia si a decedat dupa un an, prin reaparitia progresiei tumorale accelerate.

Cazurile 7 si 8  prezinta pacienti ale caror metastaze hepatice au fost indepartate chirurgical.

In cazul 7, inainte de interventia chirurgicala s-a administrat EV lecitin-standardizat timp de 5 luni.

Observatiile clinice ulterioare nu au evidentiat recurenta metastazelor hepatice si pacientul a decedat 5 ani mai tarziu datorita metastazelor cu alte localizari.

Consecutiv, apare intrebarea daca diversele metastaze pot reactiona la acest tratament imunomodulator in grade diferite ?

In ciuda faptului ca diversele celule tumorale pot manifesta sensibilitati diferite la raspunsurile imune ale organismului, o incarcare tumorala mare este intotdeauna susceptibila de o mai mica influenta terapeutica.

In cazul 8, pacientului i s-a administrat preoperator chimioterapie si EV lecitin-standardizat timp de 6 luni.

Dupa chimioterapia postoperatorie, s-au administrat cu regularitate EV, BioBran MGN-3, si EGG si la 31 luni postoperator nu au fost evidentiate recurente ale metastazelor hepatice.

Ultimele doua cazuri sustin ipoteza ca tratamentele pre si postoperatorii cu aceste imunomodulatoare standardizate pot imbunatati prognosticul pacientilor dupa operatia pentru metastaze hepatice.

In toate cazurile prezentate, calitatea vietii a fost influentata benefic.

Evidentele in crestere sustin faptul ca elementele celulare efectoare ale sistemului imun innascut sunt angajate in doua directii : macrofagele M1 si celulele dendritice CD1a+ (DC1) generatoare de IL-12,citokine proinflamatoare si activatoare ale celulelor citotoxice efectoare (precum natural killer/NK si natural killer T/NKT), care sunt puternice inhibitoare ale cresterii tumorale. Insa ele sunt deficiente in cazul pacientilor oncologici.

Informatiile disponibile sugereaza ca macrofagele asociate tumorilor apartin prototipului populational M2[5] . M2 genereaza IL-4 oncologici pot avea cu peste 40% mai multe monocite periferice M2 fata de subiectii sanatosi, care au doar 10% monocite M2.

Celulele NK si T pot avea, de asemenea, un efect oponent asemanator .

In cancer, celulele NK si T-1au rol protectiv prin producerea IFN-gamma care, la randul sau,  activeaza celulele M1si DC1producatoare de IL-12, si celulele NKT2 inhibitoare primare ale imunitatii anti-tumorale[7],  aceste date indicand existenta unui dezechilibru al sistemului imun innascut la pacientii oncologici.

Consecutiv, a imagina interventii  de succes asupra acestui echilibru de-a lungul axei sale reglatoare poate fi periculos ca si terapii imune anticanceroase  in stadiile avansate ale bolii.

In privinta LV, a fost descris un receptor cu inalta specificitate,gangliozidul CD75,care a fost identificat la nivelul PRR al unor celule efectoare ale sistemului imunitar innascut.

Existenta acestor receptori PRR(Pattern Recogniton Receptors) poate fi explicatia capacitatii neutrofilelor si monocitelor de a lega selectiv LV din moment ce aceasta lecitina poate actiona ca si Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMP), similar unor receptori lecitin-like ai microorganismelor.

Aceasta legare selectiva poate explica de ce LV intensifica raspunsurile imune mediate celular prin mijlocirea IL-12/NK, ameliorand tulburarea generata tumoral din cadrul sistemului imun innascut.

Similar modularii EV, arabiboxylan-ul modificat, provenit din taratele de orez, a fost identificat ca si stimulator al tipului celular 1 al sistemului imun innascut, ca in cazul activitatii celulelor NK umane ,,in vitro’’si ,,in vivo’’ si al functiei fagocitice a macrofagelor.

Administrarea sa simultana cu terapia lecitinica EV face posibil un efect aditiv.

Extractul standardizat din germeni de grau contine 2,6-DMBQ, cu o concentratie de 0,4mg/g masa uscata de baza [19].

Ideea de pornire are peste 50ani si apartine lui Albert Szent-Gyorgyi (a carui descoperire a vitaminei C merge inapoi in timp si mai mult) .

Experimentele ,,in vitro "si ,,in vivo" cu EGG i-au evidentiat un efect antimetastatic semnificativ.

Asocierea EGG cu substante stimulatorii NK , precum LV si BioBran MGN 3 este promitatoare din moment ce EGG induce o atenuare in domeniul proteinelor de clasa I apartinand complexului major de histocompatibilitate(MHC).

Este bine cunoscut ca reducerea exprimarii MHC I scade activitatea receptorilor inhibitori ai efectului omorator (KIR),  rezultand o intensificare a acestui efect din partea celulelor NK asupra tintelor tumorale.

Alte proprietati biologice ale acestor preparate din plante, pot avea roluri benefice, cum ar fi stimularea apoptozei sau inhibarea ciclurilor celulare in faza S.

Totusi, investigatiile preclinice pe modele tumorale (folosind soricei glabrii xenotransplantati cu leiomiosarcom uman si cu soarece C57BL6 interleukin-12deficitar) au aratat ca, in lipsa reactiilor imune, aceste extracte din plante au avut efecte antitumorale mai slabe.

Datele preclinice, studiile de caz anterioare si observatiile clinice preliminare sustin aceste rezultate experimentale.

Extractele standardizate din plante descrise mai sus au marele avantaj de a nu cauza efecte secundare. In termenii de farmacovigilenta a EV, studii pertinente indica faptul ca terapia cu vasc este bine tolerata si nu a fost semnalate efecte adverse serioase.

S-au produs doar reactii locale  (eritem la locul injectarii,dupa 8-10ore) in procent cuprins intre 0,9 si 43.

BioBran MGN-3 a fost apreciat ca foarte sigur,dupa teste de provocare orala a intoxicarii acute,subacute,mutagenicitatii si antigenicitatii.

EGG a fost comercializat ca supliment dietar non-toxic.

Studiile toxicologice cu doze mari de EGG (3g/kg) nu au evidentiat abateri fata de loturile de control .

CONCLUZII

Utilizarea extractelor standardizate din plante,  LV si BioBran MGN 3 Arabinoxylan (care, in studii anterioare,s-a dovedit a se lega de receptorii de recunoastere ai celulelor componente ale sistemului : imun innascut,avand drept urmare ameliorarea dezechilibrului imunitar indus tumoral), in combinatie cu EGG poate fi utila in tratamentul oncologic la pacienti cu metastaze hepatice.

Scopul prezentarii acesor cazuri este de a atrage atentia asupra necesitatii unor studii clinice viitoare.

DECLARATIE DE INTERESE

Autorii declara ca nu exista situatie competitorie ori conflict de interese in ceea ce priveste acest articol. Sponsorul nu a influentat conduita studiului, interpretarile datelor si nici nu a supervizat manuscrisul.

BIBLIOGRAFIE

      .......................

       .......................

Tabelul 1:

Scurta prezentare a opt cazuri de pacienti cu metastaze hepatice

L=0,5-1ng/kg lecitina din vasc, administrat ca extract de vasc standardizat, de doua ori pe saptamana; B=12-45mg/kg BioBran MGN 3 standardizat (de doua ori pe saptamana); W=50-80mg/kg extract germeni grau standardizat pentru 2,6-dimetoxi-p-benzochinona (de patru ori pe saptamana); LN=limfonoduli;FOLFOX=Oxaliplatin+Leukovorin+5-Fluoruracil;FOLFIRI=Leukovorin+5-Fluoruracil; CR=remisie completa;PR=remisie completa;NC=nemodificat

Figura 1: Sectiuni computer tomografice (CT) de metastaze hepatice la o pacienta (cazul 5) cu o remisie partiala dupa trei luni si o remisie completa dupa opt luni. Aceasta a fost tratata cu doze mici de Xeloda (1500-2500mg/zi),  combinat cu extract din vasc (EV) lecitina de vasc(LV), BioBran MGN 3 si extract din germeni de grau (EGG)

Figura 2: A.Valorile antigenului carcinoembrionar (CEA) la o pacienta (cazul 5) cu metastaze hepatice inainte de tratament si in timpul administrarii de doze mici de Xeloda (1500-25mg/zi), in asociere cu EV/LV,BioBran MGN 3 si EGG (valori de referinta: 0-4)

               B.Valorile antigenului polipeptidic tisular (TPA) la o pacienta (cazul 5) cu metastaze hepatice inainte de tratament si in timpul administrarii de doze mici de Xeloda (1500-2500mg/zi), in asociere cu EV/LV,BioBran MGN 3 si EGG (valori de referinta:0-75) .

Figura 3: A.Valorile gamma-glutamiltranspeptidazei la o pacienta (cazul 5) cu metastaze hepatice inainte de tratament si in timpul administrarii de doze mici de Xeloda (1500-2500mg/zi),i n asociere cu EV/LV, BioBran MGN 3 si EGG (valori de referinta:7-35U/l)

                B.Valorile fosfatazei alcaline la o pacienta (cazul 5) cu metastaze hepatice inainte si in timpul administrarii de doze mici de Xeloda (1500-2500mg/zi), in asociere cu EV/LV,BioBran MGN 3 si EGG (valori de referinta:98-280U/l).

STUDIUL NR 2

Arabinoxylanul din tarate de orez, modificat-Biobran MGN 3 Arabinoxylan-sensibilizeaza celulele cancerului metastatic de san la Paclitaxel ,,in vitro''

MAMDOOH GHONEUM (1), NARIMAN K.BADR EL-DIN(2), DOAA A.ALI(2) si MAI ALAA EL-DEIN(2)

(1)Departamentul de Otolaringologie, Universitatea de Medicina si Stiinta Drew,Los Angeles,CA,U.S.A.  (2)Departamentul de Zoologie,Facultatea de Stiinta,Universitatea din Mansoura,orasul Mansoura, Egipt

REZUMAT.Context : exista un interes crescut privind tratamentele alternative care reduc toxicitatea chimioterapiei prin posibilitatea reducerii dozelor acestora din urma, dar cu pastrarea eficacitatii lor asupra celulelor canceroase.

Studiile anterioare au demonstrat ca arabinoxylanul din taratele de orez,  BioBran MGN-3,  sensibilizeaza celulele cancerului de san uman (CCS uman) ata de  daunorubicina (DNR).

In studiul de fata, se evalueaza in continuare capacitatea BioBran MGN-3 de a sensibiliza aceste celule fata de un alt agent chimioterapic, paclitaxel.

Materiale si Metode:celule non-metastatice MCF-7(CCS uman) dar si metastatice 4T1(CCS murin) au fost cultivate in prezenta a diferite concentratii de Paclitaxel si in prezenta ori absentaBioBran MGN-3.

Au fost studiate: supravietuirea celulara, afectarea ADN, si proliferarea celulara.

Rezultate:MGN-3 a crescut vulnerabilitatea ambelor tipuri oncocelulare la paclitaxel de peste 100 de ori. Per ansamblu, BioBranMGN-3 actioneaza sinergic cu paclitaxel-ul prin producerea de leziuni ale ADN-ului, intensificand apoptoza si inhiband proliferarea celulara in cazul culturilor 4T1.

Concluzii: datele studiului demonstreaza caBioBran MGN 3 este un chimiosensibilizator eficient si poate sa reprezinte un nou adjuvant in tratamentul cancerului de san cu metastaze.

Cancerul ramane cea mai raspadita cauza de mortalitate in lume, responsabil de pierderea a peste 6 milioane de vieti omenesti anual.

Chimioterapia este considerata principalul suport terapeutic in cazul multor tipuri de cancer. Totusi, multi agenti chimioterapeutici au limitari ale dozelor cauzate de toxicitatea lor intrinseca(1-5). Prin urmare, exista un interes crescand in identificarea compusilor care pot spori sensibilitatea celulelor canceroase fata de agentii chimioterapeutici conventionali, astfel reducand toxicitatea direct legata de citostatice(6-9).Cercetarile  initiale ale laboratorului prezentului studiu au aratat ca,  BioBran MGN 3, sensibilizeaza celulele leucemiei umane HUT78 in a apoptoza ca urmare a actiunii anticorpilor anti CD95(cluster of  differentiation 95), dar si CCS umane ca urmare a actiunii daunorubicinei,,in vitro''\.

Studiile ulterioare au relevat efectul sinergic al asocierii BioBran MGN-3 cu chemoembolizarea uleioasa transarteriala in cazuri de pacienti cu carcinom hepatocelular. In studiul de fata, s-a considerat ca foarte importanta continuarea cercetarilor in ceea ce priveste capacitatea BioBran MGN-3 de chimiosensibilizare oncocelulara fata de un alt agent chimioterapeutic, si anume paclitaxel, denumit uzual taxol.

   Au fost studiati cativa produsi extrasi din taratele de orez in ceea ce priveste capacitatea lor de activitate antitumorala, incluzand polizaharidul RBS(13), fractiunea lipoproteinica(14), si aglutinina-RBA(15).

In plus, un studiu recent a aratat ca orezul (Oryza sativa L.) inhiba cresterea celulelor leucemiei umane U937, prin activarea celulelor mononucleare circulante (16) BioBran MGN-3 este un produs natural obtinut in urma reactiei dintre hemiceluloza taratelor de orez si o multitudine de enzime carbohidrati-hidrolitice continute de ciupercile Shiitake.

Compusul principal al BioBranMGN-3 este arabinoxylan-ul, care are o xyloza in lantul principal si un polimer de arabinoza in catena laterala(17). A fost deja evidentiat rolul BioBran MGN-3 ca si un puternic modulator al raspunsului biologic uman prin celulele natural killer(NK)(18-20).Tot acesta activeaza celulele dendritice umane(21,22),intensifica proliferarea celulelor T si B (17) si functia fagocitica a macrofagelor(23).  In continuare, alte studii au demonstrat ca administrarea de BioBran MGN-3 soarecilor purtatori de tumori a avut ca efect reduceri semnificative ale volumului tumorilor(24). Bazati pe rezultatele lor anterioare, autorii au initiat prezentul studiu in scopul continuarii cercetarilor asupra capacitatii de chimiosensibilizator al BioBran MGN 3 si anume, de aceasta data, in cazul Paclitaxel-ului utilizat impotriva CCS uman metastatic, cu elucidarea modului sau de actiune.

MATERIALE si METODE

Medicamente si reactivi.Paclitaxel-ul a fost achizitionat de la Sigma-Aldrich,Inc.(St.Louis,MO,USA).RPMI-1640cu adaos de ser fetal de vitel10%(SFV ),3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromat (MTT) de la Sigma-Aldrich.BioBran MGN-3 a fost furnizat de catre Daiwa Pharmaceutical Co.Ltd.(Tokyo,Japonia) si a fost disolvat in mediu complet (CM) in concentratie de 30 mg/ml.

Liniile celulare tumorale si conditiile de cultura. Liniile celulare CCSuman tip MCF-7 si CCSmurin tip 4T1, care metastazeaza pulmonar, au fost suportul acestui studiu.Celulele au fost achizitionate de la American Tissue and Culture Collection(ATCC,Manassas,VA,USA). Celulele tumorale au fost mentinute in CM constand in RPMI-1640,imbogatit cu SFV 10%,glutamina 2 mM si 100 micrograme/ml penicilina/streptomicina.

Efectul asocierii dintre chimioterapie si BioBran MGN-3 asupra cresterii CCS, studiu asupra sensibilitatii la medicament.Sensibilitatea la medicament a fost stabilita prin utilizarea unui test colorimetric MTT. Celulele canceroase (10000/geoda) au fost cultivate pe placi a cate 96 geode, triplicat, in prezenta ori absenta a diferite concentratiii de BioBran MGN-3(100-1000mg/ml), ca si in prezenta ori absenta unor concentratii selectate de paclitaxel(de la 1/10 la1/1000000M). Volumul final al mediului in fiecare geoda, dupa adaugarea de BioBran MGN-3ori de paclitaxel a fost de 0,2ml. Culturile au fost incubate la 37°C, timp de 24 sau 48 ore, dupa care s-au adaugat 50mg MTT fiecarei geode iar culturile au fost incubate pentru inca 4 ore. Placile au fost apoi centrifugate, mediul a fost indepartat cu grija, cristalele formate au fost dizolvate cu amestec acidoalcoolic iar placile au fost citite in lumina de 590 nm, folosind un cititor ELISA(Molecular Devices,Menlo Park,CA,USA). Concentratia inhibitorie de 50%(IC 50) a fost stabilita pentru concentratia in care medicamentul a determinat reducerea cu 50% a viabilitatii oncocelulare. IC50 a fost calculat prin analizarea graficelor reprezentand logaritmii concentratiilor medicamentului versus ratele de supravietuire a oncocelulelor supuse medicatiei.

 Metoda excluderii prin albastru de trypan. Utilizandu-se eprubete sterile, celulele si chimioterapicele au fost tratate cu concentratii diferite de BioBranMGN-3, de Paclitaxel sau cu amestec de BioBran MGN-3 plus Paclitaxel, in esantioane triplicate. Celulele au fost incubate pentru 24 sau 48 ore la 37°C,in atmosfera umeda de 5%CO2,sterila.Celulele viabile au fost numarate prin excludere cu albastru de trypan, utilizand un hemocitometru. Procentajul celulelor vii a fost obtinut divizand numarul celulelor vii la numarul total de celule. Toate determinarile au fost efectuate triplicat.

 Analiza flow-citometrica a apoptozei, leziunile ADN si proliferarea celulara. Detectarea cantitativa a apoptozei, lezarea ADN si proliferarea celulara in cazul celulelor 4T1, tratate cu BioBran MGN-3, cu sau fara asocierea de paclitaxel, au fost simultan determinate prin analiza flow-citometrica in culori, utilizand kit-uri de Apoptoza, ADN lezat si de Proliferare Celulara-bazate pe bromdeoxiuridina(Br d U)incorporata,pe H2AX fosforilata(gamma H2AX)si pe poli ADP ribozo-polimeraza splitata (PARP)(BD Biosciences Pharmingen'San Diego,CA,USA). Urmand instructiunile producatorului,celulele au fost cultivate in CM, cu sau fara diferite concentratii de BioBran MGN-3 (500micrograme/ml si 600micrograme/ml), cu sau fara Paclitaxel(1/1000M), pentru 24 sau 48 ore. Zece microlitri de solutie de lucru de BrdU (1mM BrdU la 1de DPBS) au fost adaugati fiecarui mililitru de mediu tisular de cultura (densitatea culturilor celulare a fost de aproximativ1000000celule/ml), apoi celulele au fost incubate pentru 30minute la gheata. Celulele au fost spalate prin adaugarea a cate 1ml solutie tampon colorant/eprubeta si centrifugare (5min) la 250×g,iar supernatantul a fost indepartat.Celulele au fost fixate cu 0,1ml solutie BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization, fiecare eprubeta,apoi incubate 30minute la temperatura camerei.In continuare, celulele au fost spalate cu 1ml de solutie BD Perm/Wash Buffer/eprubeta,centrifugate, supernatantul indepartat. Celulele au fost incubate in 0,1ml solutie Cytofix/Cytopwrm Plus Permeabilization Buffer/eprubeta 10minute la gheata,,spalate si apoi refixate pentru 5minute. Celulelor li s-a adaugat 0,1ml DNaza diluata,cu incubarea lor pentru o ora la 37°C,apoi spalate. Celulele au fost resuspendate cu 0,02ml solutie tampon de spalare plus PerCP-Cy™5,5mouse anti-BrdU (5microL/test), plus Alexa Fluor®647mouse anti-H2AX(pS139 (5microL/test),PE anti-PARPsplitat (Asp214) (5microL/test) timp de 20minute la intuneric, apoi spalate.Celulele au fost resuspendate in solutie tampon coloranta in vederea analizarii /sortarii celulelor activate prin fluorescenta(FACS Calibur; BD Biosciences,SanJose,CA,USA), folosind CellQuest 3,3software (25,26).

Analiza statistica.Valorile sunt calculate ca si medii±SD si au fost analizate folosind metoda analizei fluctuatiilor variabilei unice, comparate apoi cu multiple teste anterioare.Valoarea,,p''sub 0,05 a fost considerata statistic semnificativa.

REZULTATE

Efectele BioBran MGN-3 neasociat in privinta supravietuirii celulelor MCF-7:a fost examinat la 24 si la48 ore de cultivare a celulelor canceroase in prezenta BioBran MGN-3. Datele  obtinute folosind testarea cu MTT sunt reprezentate in Figura 1si arata ca tratamentul cu BioBran MGN-3 s-a materializat intr-o scadere a procentului de celule canceroase viabile la 24 ore. Valoarea IC50 a fost de1000micrograme/ml.Efectul citotoxic devine mai evident la 48 ore, cand valoarea IC50 a fost de aproximativ 800 micrograme/ml. Rezultate similare s-au obtinut cu albastru de trypan.

Efectele BioBran MGN- asupra sensibilitatii MCF-7 la paclitaxel. Datele testarilor cu MTT din Figura 2 arata ca supravietuirea celulelor MCF-7 a fost inhibata dupa cultivarea acestora in prezenta paclitaxel-ului. Pe de alta parte, co-cultivarea acestui tip celular cu BioBran MGN-3 plus paclitaxel a produs o reducere mult mai evidenta a supravietuirii celulare decat folosirea doar a paclitaxel-ului. Efectul sensibilizant al BioBran MGN-3Arabinoxylan urmeaza un model dependent de doza. La 24 ore, valoarea IC50 pentru paclitaxel a scazut cu peste 100, pentru concentratii ale BioBran MGN-3Arabinoxylan de 600,750si1000 micrograme/ml,comparativ cu utilizarea doar a paclitaxel-ului (Figura2A). Reducerea, in continuare, a IC50,poate fi observata la 48ore (Figura2B). Rezultate similare au fost obtinute prin folosirea albastrului de trypan (date nereprezentate in acest studiu).

Efectele BioBran MGN-3 neasociat in cazul supravietuirii celulelor 4T1.Datele din Figura 3 arata ca MGN-3 a redus supravietuirea celulelor 4T1dupa un model dependent de doze, asa cum reiese prin examinarea cu MTT. S-a evidentiat un remarcabil efect citotoxic al BioBran MGN-3 la 24ore : valoarea IC50 a fost de aproximativ 700micrograme/ml. La 48 ore de cultivare a celulelor 4T1 in prezenta BioBran MGN-3 A, valoarea IC50 a scazut, in continuare, la aproximativ 580micrograme/ml. Date similare au fost obtinute prin utilizarea albastrulyi de trypan (nereprezentate in studiu). .

Efectele BioBran MGN-3 asupra sensibilitatii celulelor 4T1l a Paclitaxel. Supravietuirea celulelor 4T1 dupa cultivarea lor in prezenta doar a Paclitaxel-ului a fost inhibata; oricum, o accentuare a inhibarii a fost evidentiata prin cultivarea acestui tip celular in prezenta asocierii BioBran MGN-3 cu paclitaxel. Efectul sensibilizant al BioBran MGN-3 urmeaza modelul dependent de doza. Datele din figura 4A arata ca, la 24ore, valoarea IC50 pentru paclitaxel a scazut cu aproximativ 3 la o concentratie a BioBran MGN-3 de 600 micrograme/ml, cu peste 100 la o concentratie a BioBran MGN-3 de 1000 micrograme/ml, comparativ cu utilizarea doar a paclitaxel-ului. Efecte citotoxice mai marcate ale acestui co-tratament se observa la 48ore (Figura 4B). Rezultatele au fost reconfirmate prin utilizarea albastrului de trypan (date nereprezentate in studiul de fata) .

Sensibilitatea diferentiata a celulelor 4T1 versus cele de tip MCF-7 la Paclitaxel asociat sau nu cu BioBran MGN-3. Autorii au comparat sensibilitatea celulelor MCF-7 non-metastatice si a celor metastatice 4T1la paclitaxel,cu sau fara BioBran MGN-3 asociat. Rezultatele au aratat ca tipul celular 4T1 este mult mai sensibil decat cel MCF-7 la toxicitatea Paclitaxel-ului, fie singur, fie in combinatie cu BioBranMGN-3, asa cum indica supravietuirea celulara folosind testarea MTT. Expunerea ambelor tipuri oncocelulare la paclitaxel, singur sau in combinatie cu BioBran MGN-3 arata ca IC50 pentru celulele 4T1este mai scazut decat al celulelor MCF-7 la 24 si 48ore.

Studierea leziunilor ADN,proliferarii celulare si a apoptozei a fost,prin urmare,realizata doar folosind tipul celular 4T1, in vedera elucidarii mecanismelor de actiune a BioBran MGN-3.

Lezarea ADN la nivelul celulelor 4T1.Efectul MGN-3 (500 si 600 micrograme/ml) si al Paclitaxel-ului (1/1000M) asupra procentajului leziunilor ADN celular 4T1a fost analizat, datele din Figura 5 aratand ca tratarea acestor celule doar cu paclitaxel a crescut semnificativ procentajul leziunilor ADN (p<0,01), comparativ cu lotul celular de control, netratat. Pe de alta parte, expunerea celulelor 4T1la asocierea Paclitaxel cu BioBran MGN-3 s-a materializat intr-o marcata crestere a procentajului leziunilor ADN, care a fost mai mare decat cel realizat de catre fiecare agent terapeutic utilizat singur. Efectul chemosensibilizant al BioBran MGN-3 a fost semnificativ la 24ore si a crescut in continuare la 48ore(p<001) .

Proliferarea celulelor 4T1. Figura 6 arata efectul BioBran MGN-3 (500si600micrograme/ml) si paclitaxel (1/1000M) asupra procentajului proliferarii celulelor 4T1.Tratarea acestor celule cu paclitaxel a avut ca efect inhibarea proliferarii celulare la 24 ore, care continua la 48ore (p<0,05), in comparatie cu lotul celular 4T1 de control, netratat. In mod similar, proliferarea celulelor 4T1 a scazut prin expunerea doar la BioBran MGN-3 in concentratie de 500micrograme/ml (p<0,05) si de 600 micrograme/ml (p<0,01) timp de 24 si 48ore, comparativ cu lotul celular 4T1netratat. Mai mult, co-cultura celulelor 4T1cu MGN-3 plus Paclitaxel a aratat ca inhibarea proliferarii celulare in acest caz a fost mai mare decat atunci cand fiecare din acesti agenti a fost folosit singur (p<0,01) .

Apoptozarea celulelor 4T1. A fost examinat efectul BioBran MGN-3 la concentratii de 500 si 600micrograme/ml si al Paclitaxel (1/1000M) asupra procentajului de apoptozare celulara 4T1. Datele prezentate in Figura 7 arata ca tratarea cwlulelor 4T1 doar cu paclitaxel a crescut apoptozarea acestora la 24ore (p<0,05) si,mai departe,la 48ore(p<0,01) .Dupa un model dependent de doza, BioBran MGN-3 a intensificat semnificativ apoptoza celulelor 4T1(p<0,01). Expunerea celulelor 4T1la MGN-3 plus Paclitaxel s-a materializat intr-un procentaj mai mare al apoptozarii acestora comparativ cu utilizarea fiecaruia dintre acesti agenti in parte (p<0,01) .

DISCUTII

Paclitaxel-ul, un produs natural extras din arborele de tisa, este considerat a fi un foarte puternic agent chimioterapic, util in tratarea mai multor tipuri de cancer, precum cele de san, ovar, prostata, esofag, plaman( non-small ) si melanom(27,28). Efectul apoptotic al Paclitaxel-ului asupra celulelor este demonstrat a fi dependent de doza (27,28), concentratii mici (5-25nM) putand induce apoptoza celulelor cancerului tiroidian anaplastic (ATC) ,,in vitro''(30). Totusi, o concentratie mai mare este necesara pentru inducerea apoptozei celulelor canceroase in practica clinica (31-34). Astfel de doze mari de paclitaxel sunt insa asociate cu efecte secundare severe incluzand neutropenia, nevralgia si toxicitatea gastrointestinala (28,35,36). Astfel sunt urgent necesare cercetari care sa permita alegerea unei concentratii optime de Paclitaxel care sa provoace moartea celulelor canceroase in conditiile unor lezari minime ale tesuturilor normale.

Datele studiului de fata indica potentialul BioBranMGN -3 de a reduce chemotoxicitatea Paclitaxel-ului prin reducerea concentratiei necesare distrugerii celulelor canceroase. Valoarea IC50 pentru paclitaxel a fost redusa de peste 100 de ori atat pentru celulele MCF-7 cat si pentru cele de tip 4T1, in prezenta BioBran MGN-3.

BioBran MGN-3 are capacitatea de a sensibiliza celulele canceroase si la alte tipuri de chimioterapice, cum ar fi DNR(11). Mai mult, in studii pe animale, BioBran MGN-3 s-a dovedit benefic si in a proteja impotriva pierderii severe de greutate cauzata de cisplatin(37). Rolul protector al acestuia s-a demonstrat si in cazul unor modificari patologice grosiere la nivelul tractului gastrointestinal, ca si in preventia mortii cauzate de chimioterapie(38).  In plus, rezultatele obtinute de la loturile clinice cu carcinom hepatocelular si de la alte tipuri de cancere rapid-progresive au aratat faptul ca asocierea chimioterapiei cu BioBran MGN-3 a crescut rata supravietuirii, a scazut procentajul recurentelor si a imbunatatit semnificativ apetitul acestor pacienti in raport cu aceeia tratati doar cu chimioterapice (12,39).

Autorii au aratat anterior mecanismul (~ele) prin care BioBran isi exercita efectul sensibilizator la DNR : capacitatea acestuia de a creste acumularea acestui chimioterapic la nivelul CCS uman(11). Rezultatele studiului de fata au aratat ca BioBran MGN-3 actioneaza sinergic cu paclitaxel-ul in a cauza lezarea sporita a ADN-ului din celulele 4T1, intensificandu-le apoptoza si inhibandu-le proliferarea. Efectele combinate ale asocierii paclitaxel cu BioBran MGN-3 au fost mai puternice decat in cazurile de utilizare separata a acestora.

Unii agenti potenteaza efectul citotoxic al chimioterapicelor asupra celulelor canceroase prin cresterea acumularii intracelulare a medicamentului si prin capacitatea lor de a induce reversibilitatea rezistentei multimedicamentoase (MDR) a  celulelor canceroase, incluzand blocantul canalelor de calciu diltiazem,alcaloidul biscoclaurin cefarantin (40,42), antiaritmicul chinidina (43,44) si derivatul sintetic de izotiocianat E-4IB(45) .

Pe langa acestea, s-a studiat interventia nutritionala in raport cu responsivitatea tumorala la chimioterapie. Au fost utilizati acizii grasi polinesaturati omega-3 in scopul cresterii acumularii medicamentoase in celulele canceroase(9).Oricum, studii anterioare ale autorilor au aratat ca BioBranMGN-3 reverseaza MDR in cazul celulelor HL60/AR(46).

Cercetarile din ultimii peste douazeci de ani au aratat ca multe medicamente anticanceroase actioneaza prin inducerea apoptozei (47-49). Autorii au examinat rolul BioBran MGN-3 in activarea caspazei.

Tratamentul cu BioBran MGN-3 a avut ca efect cresterea numarului de CCS umane avand activate caspaza-8;~9in celulele MCF;~3,~8,~9in celulele HCC70(50); in plus, efectul sensibilizant al BioBran MGN-3 prin care celulele leucemiei umane HUT 78 au suferit o intensificare a apoptozei induse de anticorpii CD95 a fost corelat cu o crestere a numarului celulelor avand activate caspazele-3,-8 si-9(10). Aceasta sugereaza faptul ca BioBran MGN-3 sensibilizeaza celulele canceroase la DNR printr-un mecanism interesand o activare caspazica,,in cascada''. Observatii similare au fost comunicate de Bodo si colaboratorii, conform carora acumularea intracelulara crescuta prin tratamentul cu derivatul sintetic de izotiocianat E-4IB a fost insotita de stimularea activitatii caspazei-3(45). In prezentul studiu, autorii au observat ca tipul celular 4T1tratat cu paclitaxel a prezentat leziuni ADN asociate cu o inhibare a proliferarii celulare. Paclitaxel-ul induce oprirea ciclului celular si apoptoza in cazul majoritatii tipurilor de celule canceroase (51) .

Perspectiva actiunii anticanceroase a orezului si derivatilor extrasi din taratele sale a constituit obiectivul multor studii. BioBran MGN-3 este un arabinoxylan extras din taratele de orez (17) si poseda proprietati imunomodulatorii pentru diverse celule imunocompetente, precum celulele dendritice(DC),NK,celulele -T/-B si macrofagele(17-23) ; creste productia de cytokine precum factorul necrotic tumoral-alfa si interferonul-gamma (52).

Pe langa acestea, BioBran MGN-3 s-a dovedit a fi un nou agent antitumoral capabil sa sensibilizeze celulele leucemiei umane la apoptoza indusa prin receptorii CD95(10), sa induca apoptoza,,drojdiei''in cazul celulelor canceroase (50) si a CCS umane la DNR (11). Mai mult, rezultatele acestui studiu au aratat ca BioBran MGN-3 exercita un efect sensibilizator la Paclitaxel asupra celulelor celulelor metastatice 4T1. Aceste date pot sugera faptul ca suplimentul alimentar BioBran MGN-3, asociat chimioterapiei cu Paclitaxel, poate fi util tratamentului cancerului de san metastatic.

MULTUMIRI sunt adresate de catre autori  catre Daiwa Pharmaceutical Co.Ltd.,Tokyo,Japonia,pentru suportul financiar al acestui studiu.

N.B.Acest studiu este accesibil gratuit online.Adresa de corespondenta:Mamdooh Ghoneum,Ph.D.Department of Otolaryngology,Drew University of Medicine and Science,Los Angeles,CA,USA,Tel.+1 3104746724,Fax+1 3235635953,e-mail mghoneum@ucla.edu

Figura 1: BioBran MGN-3 neasociat reduce rata supravietuirii celulelor MCF-7. Utilizand metoda testului MTT,celulele MCF-7au fost incubate in prezenta BioBran MGN-3(100-1000micrograme/ml),timp de 24si 48ore. Jumatatea concentratiei inhibitorii maxime(IC50) este indicata prin sageti.

Figura 2: Co-cultivarea BioBran MGN-3 a sensibilizat celulele MCF-7 la paclitaxel a produs o descrestere liniara a supravietuirii celulare.Celulele MCF-7au fost co-cultivate in prezenta a diferite concentratii de BioBran MGN-3si paclitaxel pentru 24ore(A)si 48ore(B). Jumatatea concentratiei inhibitorii maxime(IC50) pentru fiecare combinatie este indicata prin sageti.

Figura 3 : BioBran MGN-3 neasociat reduce rata supravietuirii celulelor 4T1. Folosind metoda testarii MTT, celulele 4T1au fost incubate cu BioBran MGN-3(100-1000micrograme/ml) timp de 24si 48ore. Jumatatea concentratiei inhibitorii maxime(IC50)este indicata prin sageti.

Figura 4: co-cultura cu BioBran MGN-3 a sensibilizat celulele 4T1 la Paclitaxel, determinand o scadere liniara a supravietuirii celulare.Celulele 4T1 au fost co-cultivate in prezenta a diferite concentratii de BioBran MGN-3si Paclitaxel,timp de 24(A)si 48(B)ore. Jumatatea concentratiei inhibitorii maxime (IC50) pentru fiecare dintre combinatii este indicata prin sageti.

Figura 5: Leziunile ADN in cazul celulelor 4T1.A fost studiat efectul Paclitaxel-ului (1/1000M), al MGN-3(500si600micrograme/ml), precum si al asocierii Paclitaxel plus BioBran MGN-3 in ceea ce priveste leziunile la nivel de ADN.Leziunile ADN in cazul celulelor 4T1 au fost determinate prin flow-citometrie.Datele reprezinta medii±SD ale determinarilor,efectuate triplicat;p<0,01in comparatie cu lotul de control al celulelor 4T1, netratate.

Figura 6: Proliferarea celulelor 4T1.Efectul Paclitaxel-ului neasociat(1/1000M)si in combinatie cu BioBran MGN-3 (500si 600micrograme/ml) asupra proliferarii celulelor 4T1.Efectul proliferarii celulelor 4T1 a fost determinat folosind flow-citometria.Datele reprezinta mediile±SD experimentelor efectuate triplicat.#p<0,05; *p<0,05 comparativ cu lotul de control al celulelor 4T1 netratate.

Figura 7: Apoptoza celulelor 4T1.A fost examinat efectul Paclitaxel-ului neasociat (1/1000M),BioBran MGN-3 neasociat si cel al asocierii dintre paclitaxel si BioBran MGN-3,asupra apoptozei celulelor 4T1 la 24si 48ore. Procentajul apoptozei celulelor 4T1 a fost determinat prin flow-citometrie.Datele reprezinta mediile±SD experimentelor efectuate triplicat.* p<0,05; # p<0,01,nivel comparat cu lotul celulelor 4T1,netratat.

STUDIUL NR 3

Efectele terapeutice ale BioBran-ului, Arabinoxylan modificat din tarate de orez, prin imbunatatirea simptomelor diareei de tip predominant ori de tip mixt din sindromul de colon iritabil: un studiu pilot, controlat, aleator

Takeshi Kamiya(1),Michiko Shikano(1),Mamoru Tanaka(1),Keiji Ozeki(1),Masahide Ebi(1),Takahito Katano(1),Shingo Hamano(1),Hirotaka Nishiwaki(1),Hironobu Tsukamoto(1),Tsutomu Mizoshita(1),Yoshinori Mori(1),Eiji Kubota(1),Satoshi Tanida(1),Hiromi Kataoka(1),Noriaki Okuda(2)si Takashi Joh(1)

(1):Departamentul de Gastroenterologie si Metabolism,Facultatea de Stiinte Medicale a Universitatii Nagoya City,1 Kawasumi,Mizuho-cho,Mizuho-ku,Nagoya 457-0036,Japonia

(2): Okuda Naika Clinic,2-9-3 Hinata-cho,Mizuho -ku,Nagoya 467-0047,Japonia

Corespondenta poate fi adresata catre Takeshi Kamiya: kamitake@med.nagoya-cu.ac.jp.       Editor academic: Jiande Chen

COPYRIGHT 2014 Takeshi Kamiya si colab.Acesta este un articol cu acces deschis,distribuit sub Creative Commons Attribution License,permitand folosirea sa nerestrictionata, distribuirea si reproducerea sa pe orice suport,cu conditia citarii corecte a lucrarii originale.

CONTEXT.Recent, s-a demonstrat ca inflamatia mucosala in grad redus si/sau dezechilibrul imun al tractului digestiv inferior reprezinta unul din mecanismele implicate in generarea simptomatologiei in cazul pacientilor cu sindromul colonului iritabil (SCI).

BioBran-ul,compus arabinoxylanic din taratele de orez,a fost evidentiat a avea actiuni biologice precum cea anti-inflamatorie si cea imuno-modulatoare.

Astfel,autorii au studiat efectele terapeutice ale BioBran-ului la pacientii cu SCI.

METODA.Patruzeci de pacienti suferind de SCI, cu diaree de tip predominant sau mixt au fost repartizati aleator fie intr-un grup tratat cu BioBran, fie intr-un grup placebo. Eficienta terapeutica si simptomatologia SCI au fost apreciate subiectiv de catre pacienti dupa 4 saptamani de administrare.

REZULTATE.Aprecierea globala a fost posibila la 63,2% in grupul BioBran si la 30%in grupul placebo (p<0,05 grup Biobran versus grup placebo).

Grupul BioBran a prezentat o scadere semnificativa a scorului diaree/constipatie si a valorilor CRP.

Dar nu au fost observate schimbari semnificative in grupul placebo.

CONCLUZII.Administrarea de BioBran imbunatateste simptomatologia in SCI.Pare probabil ca efectele anti-inflamatorii si imuno-modulatorii ale BioBran-ului sa fie utile in cazul pacientilor suferind de SCI.

INTRODUCERE

Sindromul de colon iritabil (SCI) este o disfunctie raspandita a intestinului gros, in care discomfortul sau durerea se asociaza cu defecatia ori cu modificari de tranzit intestinal si cu defecatie dezordonata.Multe studii,din tarile vestice si din Japonia au estimat prevalenta SCI intre 10%si30%din populatia adulta. Mai mult, SCI este o problema cronica afectand toate aspectele vietii cotidiene si are un impact negativ semnificativ asupra calitatii vietii (QOL) Este larg acceptat ca, la dezvoltarea simptomatologiei SCI, contribuie diversi factori. Desi au fost propusi ca posibile cauze ale SCI tulburari ale motilitatii gastrointestinale, hipersensitivitatea  senzoriala si factori psihosomatici, nici un mecanism nu a fost definit pana in prezent. Multe tratamente pentru SCI sunt utile in mod curent, mergand de la medicamente cu specificitate, precum antagonistii 5-HT3 si antidepresive, si pana la tratamente non-farmacologice, incluzand hipnoterapia. Multe dintre ele sunt nesatisfacatoare, generand necesitatea unor noi studii de elucidare a patogenezei acestui sindrom.

Recent, s-a ajuns la un consens privind faptul ca un grad scazut de inflamatie a mucoasei si/sau un dezechilibru imunitar, la nivelul tractului digestiv inferior reprezinta unul din mecanismele implicate in generarea simptomatologiei pacientilor cu SCI. Cateva studii [10-14] au relevat faptul ca pacientii cu SCI pot prezenta inflamatie a mucoasei la biopsiile prelevate din colon,rect si ileon terminal. Aceste studii au aratat ca pacientii cu SCI au un numar crescut de celule inflamatorii, incluzand limfocite, celule dendritice si mastocite la nivel mucosal, iar 1/2dintre pacientii cu SCI au aspectul inflamator microscopic comparabil cu cel din colite.Mai mult, SCI poate aparea la 7%-30%dintre pacientii convalescenti dupa o enterocolita acuta, situatie denumita SCI postinfectios[15-17]

Arabinoxylanul modificat, provenit din taratele de orez (Biobran) este foarte solubil in apa, compus fiind din polizaharide, in majoritatea lor hemiceluloze arabinoxylanice. A fost comercializat,de peste 10 ani, in peste 40 tari, incluzand America de Nord,Europa si Japonia, ca supliment alimentar functional.BioBran a demonstrat a avea  o serie de proprietati imuno-modulatorii. Unele studii au comunicat faptul ca administrarea orala de BioBran intensifica activitatea celulelor natural killer (NK) la subiectii sanatosi umani si la cei murini varstnici [18,19],precum si proliferarea  limfocitelor (celulelor T si B)[20]si induce o crestere semnificativa a activitatii unor citokine adica IFN-alfa,IL-6,IL-8si IL-10[21].

In plus,BioBran intensifica fagocitoza lui E.Coli si produce o inductie semnificativa de citokine prin neutrofile si monocite,precum si o reducere a toxicitatii agentilor chimioterapeutici[22,23].

Nu multe studii au analizat efectul imuno-modulatoarelor asupra manifestarilor din SCIScopul acestui studiu este de a investiga efectele terapeutice ale BioBran-ului in cazul pacientilor cu SCI.

METODE

Descrierea studiului si a pacientilor. Acest studiu pilot a avut caracteristicile urmatoare:aleator, dublu orb, raportare placebo/control.

Pacientii studiului au fost>20ani, cu SCI definit dupa criteriile Roma III in ceea ce priveste forma de diaree predominanta (IBS-D) ori de tip mixt (IBS-M).

Pacientii aveau discomfort sau durere abdominala,asociate cu scaune neformate sau apoase in cel putin 2 zile pe saptamana in ultimele 3 saptamani anterioare studiului.

Pacientii studiului trebuiau sa fi efectuat colonoscopia sau colonografia in perioada de un an premergatoare studiului, pentru a se indeparta posibilitatea unor cauze organice ale simptomatologiei.

Urmatoarele cauze de excludere a pacientilor din studiu au fost utilizate: (1) leziuni organice gastrointestinale, precum ulcerul peptic, boala Crohn, colita ulcerativa si pancreatita; (2)istoric de interventii chirurgicale abdominale majore; (3) afectiuni demonstrate cardiovasculare, gastrointestinale, metabolice, psihice sau maligne; si (4) graviditatea,lactatia,sau planificarea sarcinii. Pacientii care au folosit cu 2 saptamani inaintea selectarii medicatii cunoscute ca putand modifica functia gastrointestinala nu au fost,de asemenea, eligibili.

Nici pacientii aflati sub tratament antiinflamator steroidian sau non~,ori antibiotic nu au fost admisi, ca si cei considerati inoportuni de catre investigatori.

Daca au fost prescrise medicatii pentru afectiuni coexistente inainte de inceperea studiului,acestea au fost continuate pe perioada sa,fara a se solicita modificarea dozelor sau ritmului de administrare.

Insa alte terapii concomitente,considerate a avea impact asupra evaluarilor din studiu,nu au fost acceptate pana la finele acestuia.

Pacientii au fost impartiti aleator,prin extragere numerica,de la 1la 40,cu ajutorul computerului,urmand sa primeasca fie 1g BioBran pudra(3,52kcal,752mg carbohidrati,115mg proteine,0mg lipide,25mg fibre dietare,44mg apa,Daiwa Pharmaceutical Co.Ltd.,Tokyo,Japan), fie placebo,de 2ori pe zi, timp de 4 saptamani.

Aceasta doza de BioBran este una comuna suplimentelor nutritive.

Pudra placebo a inclus fibre dietare si a fost identica volumic,coloric si gustativ BioBran-ului.

Fiecare simptom al SCI  a fost evaluat fata de o linie bazala,saptamanal,de-a lungul intregii perioade a tratamentului.

Au fost evaluate QOLspecific gastrointestinala si gradul de anxietate,prin completarea unui chestionar inainte de~ si la sfarsitul tratamentului.Toate aspectele protocolului studiului au fost aprobate de catre Comitetul de Etica Medicala al Facultatii de Stiinte Medicale a Universitatii orasului Nagoya(numarul 211-2).Toti pacientii au fost informati asupra studiului si au semnat un consimtamant in acest sens, in conformitate cu prevederile Declaratiei de la Helsinki.

Evaluarea simptomelor.La sfarsitul  tratamentului,eficienta terapeutica globala,la nivel subiectiv,a fost evaluata de catre pacienti,in conformitate cu urmatoarele 5 categorii:

(1) imbunatatire marcata;(2)usoara imbunatatire;(3) neschimbata;(4) nu prea buna; (5) deteriorata.

Categoriile 1si 2 au fost considerate ca dovada de eficienta, iar categoriile 3,4 si 5 drept ineficienta.

In vederea evaluarii starii QOLsi de anxietate a pacientilor,acestia au completat chestionare QOL cu specific gastrointestinal-conform cu Gastrointestinal Symptom Rating Scale (GSRS)[24]-si chestionare cu specific psihologic-State Trait Anxiety Inventory (STAI) [25]-completare efectuata inainte de inceperea tratamentului (,,linia bazala'') si dupa cele 4 saptamani de tratament.Scala GSR include 15 referinte si foloseste 7 trepte (Likert), mergand de la,,fara discomfort''pana la,, foarte mult discomfort''.

Cele 15 referinte au fost combinate in 5 manunchiuri simptomatice: reflux, durere abdominala, indigestie, diaree si constipatie.

Un scor mai mare in sfera GSRS indica un discomfort mai mare.

Chestionarul STAI, constand in 40 de intrebari, 20 privind starea generala a pacientului si 20 pentru aspectele legate de anxietate, a fost raportat la valorile standardizate ale populatiei japoneze.

Testele de laborator.

Cate un esantion de sange a fost recoltat de la fiecare pacient,inainte de~ si dupa terminarea celor 4 saptamani de tratament.

Au fost studiate : numaratoarea completa a elementelor figurate ale sangelui,morfologia acestora, proteina C-reactiva, proportia celulelor B si T printre limfocitele sangelui periferic, si activitatea celulelor NK. Acestea au fost necesare pentru evaluarea modificarilor inflamatorii si imunologice.

Procentajul celulelor B si T raportat la numarul de limfocite, precum si activitatea celulelor NK au fost masurate prin flow-citometrie[26]si, respectiv, prin utilizarea izotopului 57 al cromului [26].

Catecolaminele plasmatice, adrenalina si noradrenalina, au fost monitorizate ca markeri ai stress-ului, prin cromatografie lichida inalt performanta(HPLC).

Scopul final al studiului si Statistica. Scopul primar al studiului a fost aprecierea subiectiva globala a eficacitatii BioBran-ului dupa 4 saptamani de tratament.

Rezultatele secundare s-au constituit in modificari totale si individuale ale scorurilor abdomino-simptomatice GSRS, ale scorului STAI si ale valorilor testelor de laborator.

Valorile au fost prezentate ca media±SD.

Diferentele dintre valorile mediilor grupului BioBran versus cel placebo au fost comparate prin testul Student sau prin testul U.Scorurile simptomelor SCI au fost evaluate prin analiza covariatiilor.

Scorurile GSRS si STAI, ca si valorile testelor de laborator,inainte si dupa tratamentul de 4 saptamani, au fost comparate prin testul sirurilor Wilcoxon ori prin testul,,t'', ca modalitatea cea mai adecvata.

Variabilele evidente ale evaluarii globale au fost prelucrate prin testul,,chi-patrat''.

Valorile P<0,05 au fost considerate statistic semnificative.

REZULTATE

Studiul a fost efectuat in perioada 2006-2007. Au fost cuprinsi in acest studiu 40 pacienti, in varsta de 49,2±15,1ani, cu distribuire aleatorie a cate 20 in grupurile Biobran si placebo.Subtipurile SCI conform criteriilor Roma III au fost 28 pacienti IBS-D si 12 pacienti IBS-M.Tabelul 1 arata caracteristicile bazale ale acestor pacienti(Tabelul 1). Nu au existat diferente semnificative ca si varsta, sex, vechimea bolii ori de apartenenta la unul din subtipurile IBS, intre subiectii  grupului BioBran si cel placebo. Unul dintre pacienti a fost exclus din analiza,,endpoint''intrucat nu s-a mai prezentat la spital dupa perioada de 4 saptamani (Figura 1).

Evaluarea simptomelor si a Eficientei tratamentului.Evaluarea globala a fost efectiva la 63,2%din grupul BioBran si la30%din grupul placebo (P=0,0465)(Tabelul 2)

Valorile bazale si modificarile scorurilor GSRS si STAI inainte de~ si dupa tratamentul de 4 saptamani sunt cuprinse in Tabelul 3 Nu sunt diferente semnificative in cadrul niciunui scor GSRS, atat inainte de~ cat si dupa 4 saptamani de tratament, intre grupul BioBran si cel placebo.

O imbunatatire semnificativa a scorurilor GSRS total si pe categoriile referitoare la reflux, diaree, constipatie, s-a observat dupa administrarea de BioBran.

Insa, in grupul placebo nu au fost observate modificari semnificative ale scorurilor total sau pe categorii.

Nu au fost observate modificari semnificative in scorul STAI nici la grupul BioBran,nici la cel placebo (Tabelul 3).

Testele de laborator. Modificarile din cadrul examinarilor hematologice si serologice sunt aratate in Tabelul 4.

Nu au fost observate diferente semnificative ale valorilor bazale intre grupul BioBran si cel placebo, cu exceptia numaratoarei trombocitelor. Dupa administrarea de BioBran, procentajul neutrofilelor a fost, semnificativ, mai mic decat in grupul placebo, in timp ce procentajul celulelor B la grupul BioBran a fost mai mare decat la grupul placebo.

Proportia limfocitelor in raport cu celulele albe din sangele periferic, procentajul celulelor B in raport cu limfocitele si activitatea celulelor NK dupa administrarea de BioBran, au fost semnificativ crescute in comparatie cu valorile bazale. Iar proportia neutrofilelor in raport cu celulele albe sanguine si valorile serice ale CRP au scazut semnificativ fata de valorile bazale ale grupului BioBran.

Aceste modificari nu au fost observate dupa administrarea placebo.

Grupul placebo a prezentat o diminuare semnificativa a numarului de trombocite din sangele periferic. Nu au existat modificari semnificative ale valorilor concentratiilor catecolaminelor serice la nici unul din cele doua grupuri.

Efecte adverse. Nu au existat la nici unul din cele doua grupuri.

DISCUTIE

Autorii au demonstrat efectele terapeutice de tip anti-inflamator si imuno-modulator ale administrarii de BioBran in cazul pacientilor suferind de SCI. Aceste efecte s-au tradus prin capacitatea BioBran-ului de a imbunatati simptomatologia SCI, evaluarea subiectiva fiind valabila la peste 60%dintre pacientii studiului.

Pe langa acest aspect, pacientii tratati cu BioBran au prezentat cresterea proportiei limfocitelor  si a activitatii celulelor NK. Scorurile GSRS, atat in privinta diareei cat si a constipatiei, in cazurile de SCI tratate cu BioBran, au fost semnificativ imbunatatite in comparatie cu valorile bazale.

Este larg acceptat faptul ca un grad redus de inflamatie si alterari imunologice joaca roluri importante in dezvoltarea simptomatologiei SCI [13,14]; se considera ca SCI se asociaza cu activarea unui raspuns imun adaptativ. In mediul inflamat al mucoasei colonice,permeabilitatea epiteliala crescuta [28,29] poate permite pasajul facil al antigenelor, ceea ce poate duce la o crestere a celulelor imune si la aparitia unei flore colonice anormale.

Aceste disfunctii ale colonului si activarea sistemului imun digestiv pot afecta motilitatea gastrointestinala si sensitivitatea viscerala, acestia fiind propusi drept factori patofiziologici ai SCI.

In acest studiu,rezultatele testelor de laborator au evidentiat efectele anti-inflamatorii si imuno-modulatorii ale BioBran-ului.

Dupa administrarea de BioBran, activitatea celulelor NK a crescut iar valorile CRP au scazut semnificativ, in comparatie cu nivelele bazale.De asemenea, s-au observat cresterea semnificativa a proportiei limfocitelor in raport cu celulele albe sanguine periferice, procentajul celulelor B in raport cu limfocitele, precum si o scadere semnificativa a proportiei  neutrofilelor.

Ghoneum si colaboratorii au aratat ca BioBran-ul este un puternic modificator al raspunsurilor biologice, actionand prin stimularea diferitelor cai ale sistemului imun, cum ar fi celulele NK,Tsi B[18-21].

Aceste date anterioare despre BioBran sustin rezultatele  studiului de fata.

O scadere semnificativa a numarului de trombocite a fost observata doar la grupul placebo.

O explicatie a acestei situatii poate fi partial datorata valorilor bazale mai mari ale grupului placebo.Nu s-au identificat alte date care sa explice aceasta observatie.

Cateva studii clinice [30-36] au sugerat ca tratamentul cu diverse bacterii probiotice poate ameliora simptomatologia SCI. Microflora intestinala detine un rol important in mentinerea sanatatii organismului-gazda [34-36] si are proprietate imunomodulatorie. Probioticele ofera mijloace de modificare a microflorei intestinale iar efectele lor terapeutice pot influenta raspunsurile imune [34,37] prin modificarea echilibrului mucosal intestinal.In studiul de fata, administrarea orala de BioBran a crescut procentajul limfocitelor si a intensificat activitatea celulelor NK, indicand ca acesta are efecte imuno-modulatorii la pacientii cu SCI.

In plus, BioBran-ul, un polizaharid derivat din taratele de orez,poate influenta microflora tractului digestiv.

Totusi, functiile biologice precise ale BioBran-ului nu sunt bine explicate.Sunt necesare studii viitoare pentru a clarifica mecanismele efectelor benefice ale BioBran-ului la pacientii cu SCI.

Potentialul BioBran-ului de a interveni direct asupra stress-ului psihic si supra sistemului nervos autonom a fost apreciat ca redus.

Factorii psihici sunt importanti in patogeneza SCI.

Concentratia catecolaminelor serice, inclusind noradrenalina, creste sub stress psihic, ca si prevalenta activitatii sistemului nervos simpatic[38,39]. In acest studiu nu au fost observate modificari nici ale scorurilor STAI, nici ale valorilor catecolaminelor serice, dupa administrarea de BioBran, sugerand faptul ca nu exista o legatura directa intre efectul Biobran-ului si stress-ul psihic.

Prima limita a acestui studiu a fost dimensiunea sa redusa (ca si studiu-pilot), precum si lipsa informatiilor despre valorile unor citokine-cum ar fi IL-la pacienti, inainte si dupa administrarea de BioBran.Astfel, autorii nu au putut investiga corelatia dintre profilul celulelor imune si severitatea simptomatologiei SCI.

In concluzie, acesta este primul studiu care examineaza efectele anti-inflamatorii si/sau imuno-modulatorii in cazul pacientilor cu SCI.

Autorii au evidentiat o imbunatatire semnificativa a simptomelor la cazurile tratate cu BioBran, comparativ cu cele placebo.

Aceste date  aduc o noua indicatie a tratamentului cu BioBran si anume pacientii cu SCI.

In vederea confirmarii rezultatelor autorilor, trebuiesc sustinute studii viitoare, ale populatiei generale.

CONCLUZII

Efectele imuno-modulatorii ale BioBran-ului,un Arabinoxylan modificat din tarate de orez, sunt, probabil, utile in a imbunatatii simptomatologia din SCI.

CONFLICTE DE INTERESE

Autorii declara ca nu exista conflicte de interese in ceea ce privesre publicarea acestui studiu.

MULTUMIRI

Autorii aduc multumiri dr.Mamdooh Ghoneum si dr.Yuzo Endo pentru recenzia acestui articol. Aduc, de asemenea, multumiri companiei Daiwa Pharmaceutical Co.Ltd. pentru furnizarea pulberii de Biobran si a celei placebo, ca si pentru logistica articolului. Acest studiu a fost sustinut financiar, in parte, de catre Japanese Society of Psychosomatic Medicine on Digestive Disease.

     

STUDIUL NR 4

Arabinoxylanul din tarate de orez (BioBran MGN 3 Arabinoxylan) creste citotoxicitatea mediata celular (NK) impotriva neuroblastomului, atat,,in vitro''cat si ,,in vivo''

ANTONIO PRREZ-MARTINEZ(1,2), JAIME VALENTIN(2),LUCIA FERNANDEZ(3), ENRIQUE HERNANDEZ-JIMENEZ(2), EDUARDO LOPEZ-COLLAZO(2), PETRA ZERBES(4), ELLEN SCHWORER(4), FERNANDO NUNEZ(5), INMACULADA GENESIS MARTIN(5), HANNAH SALLIS(6), MIGUEL ANGEL DIAZ(7), RUPERT HANDGRETINGER(4) si MATTHIAS MANUEL PFEIFFER(4)

1-Departamentul de Hemato-Oncologie Pediatrica a Spitalului Universitar'' La Paz'', Madrid,Spania;2-Grupul de Cercetare a Imunitatii Innascute, Institutul de Investigatii  din Spitalul Universitar''La Paz'', Madrid, Spania;3-Programul de Cercetare Clinica,Centrul National de Cercetare a Cancerului, Madrid,Spania;4-Spitalul Universitar de Copii,Universitatea din Tuebingen, Tuebingen, Germania; 5-Serviciul de Experimente pe Animale, Institutul de Investigatii Biomedicale''Alberto Sols'', Consiliul Superior de Investigatii Stiintifice Madrid,Spania;6-Scoala de Medicina,Universitatea din Cardiff,Heath Park,Cardiff,Walles,si7-Departamentul de Hemato-Oncologie si Transplant de Celule Stem,Spitalul Universitar Pediatric''Nino Jesus'',Madrid,Spania

Rezumat

Scopul studiului: activitatea citotoxica a celulelor''natural killer (NK) detine un rol major in apararea imuna impotriva starilor maligne.Celulele NK se dovedesc asadar un instrument al imunoterapiei anticanceroase.Arabinoxylanul din taratele de orez (BioBran MGN 3) a fost descris ca un modulator de raspuns biologic, ce poate intensifica activitatea citotoxica a celulelor NK. Acest studiu a evaluat efectul BioBran MGN 3 asupra activarii celulelor NK, asupra cresterii populatiei celulare si activitatii citotoxice a acestora indreptate impotriva celulelor neuroblastomatoase.

Metode:celulele NK au fost incarcate cu granule magnetice si stimulate cu BioBran MGN 3.

Activarea celulelor NK a fost evaluata prin analizarea fenotipului lor iar capacitatea lor de expansiune fost supusa marcajului.

Capacitatea citotoxica''in vitro'' a celulelor NK stimulate a fos t testata impotriva liniilor celulare K562,Jurkat,A673,NB1691,A-204,RD si RH-30,iar capacitatea citotoxica''in vivo''a fost urmarita asupra liniei celulare NB1691.

Rezultate:stimularea celulelor NK prin BioBran MGN 3 a indus o crestere a exprimarii receptorilor asociati activarii imune-CD25 si CD69-fata de celulele nestimulate(P<0,05).

Exprimarea NKG2D,DNAM,NCRs si TLRs nu s-a modificat. Stimularea nocturna a NK prin BioBran MGN 3 le-a crescut acestora activitatea citotoxica impotriva tuturor liniilor celulare testate''in vitro''si a incetinit cresterea neuroblastomica''in vivo''. Mecanismul nu este mediat de lipopolizaharidele ce contamineaza BioBran MGN 3 . Mai mult, adaugarea BioBran MGN 3a favorizat marirea numarului de celule NK si diminuarea clor de tip T''in vitro''

Concluzii : datele studiului arata ca BioBran MGN 3 intensifica activarea marker-ilor activarii celulare NK, stimuleaza citotoxicotatea NK antineuroblastomatoasa''in vitro''si''in vivo,''si creste selectiv populatia NK.

Aceste rezultate pot fi utile pentru strategii terapeutice viitoare bazate pe  mecanismul celular NK in cazurile de neuroblastom.

Introducere

Activitatea citotoxica a NK indeplineste un rol major in cadrul mecanismelor noastre naturale de aparare imunologica impotriva proceselor maligne,asa cum reiese in mod evident din faptul ca o activitate citotoxica scazuta a celulelor NK se asociaza cu un risc inalt de dezvoltare tumorala fata de populatia generala[1].

In plus, dupa un transplant de celule stem hematopoietice,activitatea citotoxica NK crescuta se asociaza cu un risc scazut de recidiva maligna[2].

Activitatea citotoxica NK poate fi imbunatatita printr-un stil de viata sanatos[3-5], prin modulatori ai raspunsului biologic[6,7], prin hormonul de crestere[8]si prin citokine[9-12]. Celulele maligne pot scadea activitatea citotoxica a celulelor NK prin eliberarea de citokine supresoare si/sau prin reducerea receptorilor activatori ai NK[13,14]. Activitatea celulelor NK poate fi, deasemenea, diminuata de catre anticorpi[15,16]si de catre chimioterapice[17].

Prin urmare, mentinerea unui nivel inalt de activitate citotoxica celulara NK trebuie sa fie scopul atat pentru pacientii oncologici, cat si pentru populatia generala.

BioBran MGN 3 este un arabinoxylan din taratele de orez, modificat prin enzimele de tip hidrolaze specifice carbohidratilor, enzime eliberate de ciupercile Shiitake[18].

Acest supliment alimentar a fost deja identificat ca si stimulator al activitatii citotoxice NK asupra  tumorilor in cazul pacientilor adulti, atat''in vitro''cat si''in vivo,''[19,20].

Mai mult, s-a descris si sinergismul efectului antitumoral in asociere cu terapia conventionala in cazul unor forme de cancer, precum cel de san si cel hepatocelular[21-25].

Aceste date au deschis calea utilizarii BioBran MGN 3 ca si tratament asociat in oncoterapia pacientilor adulti.

Totusi, nu au fost publicate studii similare din oncologia pediatrica.

Scopul studiului de fata a fost tocmai identificarea rolului BioBran MGN 3 ca stimulator al celulelor NK impotriva proceselor maligne infantile''in vitro''si''in vivo'', dar si rolul acestuia in expansiunea populatiei celulare NK, prin folosirea unor combinatii de citokine si de linii celulare cu rol stimulator.

METODE

Pregatirea celulelor

Comitetul local/institutional de etica a aprobat acest studiu, celulele mononucleare din sangele periferic(CMSPBMCs,in lb.engl.) au fost izolate prin gradient de densitate centrifugal din esantioane sanguine prelevate de le voluntari sanatosi. Sangele a fost stratificat cu atentie intr-un volum egal de solutie Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)si centrifugat la 400 G timp de 20 de minute la temperatura camerei. S-au recoltat CMSP de la nivelul interfetei si s-au spalat de doua ori cu solutie clorosodica izotonica fosfat-tamponata, apoi s-au centrifugat la 400 G pentru 10 minute. Celulele NK au fost tratate ulterior cu (micro~) granule magnetice speciale(KIT de izolare a celulelor NK sau microgranule CD56; Miltenyi Biotec-a se vedea Figura 1) Sangele integral a fost stratificat pe substrat Ficoll si centrifugat la 1800 rotatii pe minut timp de 30 de minute, la temperatura camerei. Fractiunea limfocitar/monocitara a fost izolata, spalata cu ser fiziologic/fosfat si supusa lizei eritrocitare prin tratare cu solutie de clorura de amoniu (Stem Cell Tehnologies) timp de 5minute, la temperatura camerei, urmata de o noua spalare cu ser fosfatat; monocitele au fost cultivate aderential pe mediul RPMI1640(GibcoBRL, Life Technologies Ltd.),completat cu ser fetal bovin10%,in atmosfera umeda, cu 5%CO2,la 37°C. Monocitele aderente au fost cultivate timp de 7-10zile, pentru a li se permite diferentierea in macrofage. Macrofagele au fost folosite ca biosenzori de identificarea dozei optime de BioBran MGN 3 care sa stimuleze celulele NK, fara a stimula si macrofagele.

Reactivi:

Anticorpii monoclonali uman-specifici(Ac/m/h=mAbs,in lb.engl.) folositi in studiu au fost:CD3PE-Cy7,CD45-FITC,CD69-FITC si CD314(NKG2D)-APC (reactivi proveniti de la Becton Dickinson);CD56-APC,CD25-PE,CD336(NKp44)-PE si CD335(NKp46)-PE (acestia produsi de Beckman Coulter); CD337(NKp30)-PE(Miltenyi Biotec).Ac/m/h fluorocromici anti TLR-4 si anti TLR-9au fost furnizati de  Enzo Life Sciences AG.

Interleukina(IL)-15 a fost obtinuta de laCellGenix.IL-2(Proleukina) a fost obtinuta de le Novartis.

BioBran MGN 3 a fost furnizat de Daiwa Pharmaceuticals Co Ltd.Lipopolizaharidul(LPS;Sigma 0127:B8) a fost folosit ca ligand al receptorului de avertizare TLR-4(toll-like receptor),iar polymyxina B(InvivoGen) a fost folosita ca inhibitor al activarii TLR-4 de catre LPS.

Liniile celulare

Au fost folosite ca tinte ale activitatii citotoxice celulare NK urmatoarele linii celulare: eritroleucemia K 562, eucemia limfocitara T Jurkat, sarcomul Ewing A673(toate din ATCC), linia celulara neuroblastomica NB1691 (furnizata prin amabilitatea dr.A.Davidoff, Spitalul de Cercetari Pediatrie St.Jude), rabdomiosarcomul embrionic A-204, rabdomiosarcomul RD si rabdomiosarcomul alveolar RH-30(toate din DSZM). Linia celulara neuroblastomica responsiva la luciferaza(NB1691luc) a fost pusa la dispozitie tot prin amabilitatea dr.A.Davidoff si a fost folosita atat''in vitro'' cat si,cantitativ,''in vivo'',pe subiecti murini[26,27]. Liniile celulare iradiate K562 si K562 cu exprimare membrano-celulara a IL-15 si 4-1BBL(K562-mb 15-4-1BBL,oferite prin amabilitatea dr.D.Campana, Universitatea Nationala din Singapore) au fost utilizate si celule nutritive pentru activarea si cresterea populatiei de celule NK[28].

Analiza fenotipica

Fenotipurile suprafetelor celulare ale NK stimulate timp de o noapte prin BioBran MGN 3 (100micrograme/ml)sau prin IL-15(10nanograme/ml), ca si al celulelor NK nestimulate ori doar in expansiune populationala,au fost determinate din probe provenind de la 3 voluntari adulti sanatosi;s-au folosit 6 coloranti imunofluorescenti. Au fost colorate 500.000 celule NK proaspete provenite din respectivele situatii,in prezenta de anticorpi murini anti-humani timp de 30 de minute, la intuneric si 4°C.Celulele au fost spalate de doua ori cu solutie salina fosfatata la rece, au fost resuspendate in 0,5 ml din tipul de solutie amintit si analizat flow-citometric(analizor FACS Canto II,Becton Dickinson).Procentajul pozitivarii suprafetelor celulare raportat la media intensitatii fluorescentei(MFI) a fost determinat pentru fiecare antigen de suprafata.Verificarea rezultatelor s-a efectuat folosind anticorpi isotip de control.

Testarea citotoxicitatii si stimularii celulelor NK

Citotoxicitatea naturala celulara NK a fost monitorizata in mod conventional, prin testul de eliberare in decurs de 2 ore, a 2,2'europiu 6',2''terpiridina 6,6''acid dicarboxilic (Perkin-Elmer Walac) ,standardizat deja [29]. S-au folosit ca tinte celulare liniile K562,Jurkat,A673,NB1691,A-204RD si RH-30. In sinteza, ceulele vizate au fost tratate cu un ligand intensificator al fluorescentei (2,2'bis acetoximetil 6'2''terpiridina6,6''dicarboxilat). Acest ligand hidrofobic traverseaza rapid membrana celulara.In celula, hidroliza legaturilor esterice se materializeaza si prin transformarea hidrofilica a ligandului, care nu mai poate,deci,re-traversa membrana celulara. Dar citoliza va elibera, totusi, ligandul,astfel acesta putand reactiona cu europiul,cu formarea unui chelat stabil si fluorescent, evaluabil fluorommetric(cititor Infinite F200,TECAN Group Ltd). Citotoxicitatile spontana si specifica au fost calculate dupa urmatoarele formule:

%Specific=(experimental-spontan)/(maxim-spontan)×100

%Spontan=(spontan-fond)/(maxim-fond)×100

Celulele NK de la voluntarii sanatosi au fost stimulate nocturn cu 100micrograme/ml BioBran MGN 3, cu IL-15 in concentratie de 10nanograme/ml, cu IL-2 in concentratie  fie de 40UI/ml fie de 1000UI/ml, ori cu o combinatie de BioBran MGN 3 si IL-2de 40UI/ml.

Culturile celulare au fost introduse intr-un mediu complet(RPMI 1640, suplimentat cu ser bovin fetal inactivat termic si diluat 10%, penicilina 100UI/ml,streptomicina 100nanograme/ml si glutamina 2mmol/l), in atmosfera umeda de 5%CO2si95%aer. Activitatea citotoxica a fost analizata dupa descrierea de mai sus.

Modelul murin

O cantitate de 200000 celule neuroblastomatoase NB-1691luc a fost injectata intravenos unui soarece NOD-scid IL-2Rgnull, in varsta de 12 saptamani. Pentru izolarea celulelor NK s-au utilizat CMSP de la voluntari sanatosi. Aceste celule NK au fost apoi marcate cu (micro~)granule magnetice cu rol selectiv(KIT izolator de celule NK Miltenyi Biotech).Celulele NK obtinute au fost peste 90%CD3-CD56+. S-au folosit celule NK proaspete ori activate nocturn cu 100micrograme/ml.Terapia intravenoasa cu celule NK s-a inceput dupa 7zile de la injectarea celulelor tumorale si s-a repetat de 2ori pe saptamana timp de 4saptamani. In doua experimente independente (4soareci per grup) s-a comparat cohorta netratata (grupul de control) cu o cohorta primind 1000000celule NK nestimulate (grupul NK) si cu o alta cohorta primind o cantitate identica de celule NK stimulate nocturn cu BioBran MGN 3 100micrograme/ml (grupul NK-Biobran).

Imagistica bioluminiscenta a fost utilizata dupa initierea terapiei cu celule NK,in zilele 7,14,28si 42de la injectarea intraperitoneala a 0,1ml de luciferina dizolvata in ser fosfatat, la concentratia de 15mg/ml

La cinci minute dupa administrarea substratului, animalele au fost anesteziate cu isofluorane(inductia anesteziei s-a facut la 3%iar mentinerea sa la1,5%) si au fost introduse in Xenogen IVIS Lumina II (dispozitiv imagistic cantitativ prin fluorescenta si bioluminiscenta Xenogen Corporation). Imaginile au fost captate iar diversele expuneri si analizarea acestora au fost efectuate cu ajutorul  versiunii 3.2 a programului Xenogen Living Image.Pentru secventele de imagistica prin bioluminiscenta s-au aplicat dispozitive rectangulare toraco-abdominale fiecarui subiect murin, calculandu-se fluxul total de fotoni pe secunda in pozitiile ventrala si dorsala, cu timp de expunere de 180secunde.

Valorile obtinute au fost comparate cu cele de fond(provenind de la un soarece non-tumoral,injectat cu luciferina).Toate fazele au urmat recomandarile Comitetelor de Utilizari si Ingrijiri Institutionale ale Animalelor, in acord cu criteriile Ghidului Institutului National de Sanatate privind Ingrijirea si Utilizarea Animalelor de Laborator.

Activarea si proliferarea celulelor NK

Proliferarea a fost finalizata dupa 14 zile de incubare cu sau fara prezenta BioBran MGN 3 100micrograme/ml si citokine (100UI/ml IL-2sau 100UI/ml IL-2plus10nanograme/ml de IL-15) sau cu adaugare de cocultura de celule iradiate cu rol nutritiv din liniile celulare K562ori K562-mb 15-41BBL[28]. In sinteza,CMSP au fost obtinute de la 5 voluntari adulti sanatosi,prin centrifugare in gradient de densitate (Ficoll). CMSP au fost incubate intr-o placa prevazuta cu 6 adancituri cu fundul plat,avand sau neavand MGN-3/Biobran si citokine umane (IL-2,IL-2plusIL-15) ori co-cultivate in raportul de1/1,5 cu celule nutritive din liniile K562 ori K562-mb15-41BBL,ambele dupa iradiere subletala prealabila. Mediul de cultura a fost RPMI 1640(imbogatit  cu plasma umana proaspat congelata,de grup AB (IV),diluata in prealabil 10%),L-glutamina si penicilina-streptomicina (Biochrom). Mediul acesta a fost reimprospatat la fiecare 2 zile.Dupa 14 zile,celulele au fost recoltate si au fost analizate fenotipic si ca activitate citotoxica NK''in vitro''.

Marcarea celulara si analiza flow-citometrica in vederea determinarii agonismului la nivelul TLR prin contaminarea BioBran MGN 3.

Eliberarea de factor necrozant tumoral(TNF)-alfa,IL-6siIL-8 de catre macrofagele humane dupa expunere la LPZ(10nanograme/ml)ori la BioBran MGN 3 (la concentratii de 10,100,1000si10000micrograme/ml) a fost evidentiata prin tehnica marcajului cu microgranule Flex Set(BD Biosciences),urmand protocolul producatorului,iar apoi efectuandu-se flow-citometria printr-un dispozitiv BD FACS Calibur(BD Biosciences).

Concentratia de BioBran MGN 3de 100micrograme/ml s-a dovedit a fi cea mai mare care nu induce inflamatie(cresteri ale TNF-alfa,IL-6si IL-8,Fig.1).

BioBran MGN3 a fost ecranat pentru potentialul sau efect agonistic la nivelul TLR-2,-3,-4,-5,-7,-8 si-9 prin InvivoGen.Deoarece urmele de LPZ din MGN-3/Biobran ar putea creste citotoxicitatea NK prin activarea TLR-4,determinarea contaminarii cu LPZ/endotoxina cu rol de ligand al TLR-4 in compozitia MGN-3/Biobran(100micrograme/ml) a fost efectuata de  BioChem GmbH. Mai mult,autorii au cuantificat ei insisi endotoxina LPZ prin studiu cromogenic.(ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit,GenScript).Testarile functionale ale citotoxicitatii''jn vitro''au fost efectuate pe liniile celulare K562 si NB1691 ca si tinte,folosindu-se LPZ(10nanograme/ml)drept stimulator al celulelor NK,iar polimixina B(100micrograme/ml)ca inhibitor al activarii TLR-4 prin LPZ. In sfarsit, s-au efectuat testari ale citotoxicitatii indreptate impotriva liniei celulare NB1691 prin celule NK stimulate cu BioBran MGN 3 si polimixina B ca inhibitor al efectului de''contaminare''.

Analiza statistica

Rezultatele sunt prezentate sub forma de medii ±DS(deviatii standard).Testele non-parametrice Wilcoxon au fost folosite pentru a compara efectul BioBran MGN 3 asupra fenotipului,citotoxicitatii si ratei expansivitatii celulelor NK.

Pe modelul murin,supravietuirea a fost apreciata prin metoda univariabilei Kaplan-Meier si comparata folosind testul sirurilor nemarginite.Semnificatia statistica a fost caracterizata prin P<0,05.

REZULTATE :

Fenotiparea NK

Adaugarea de celule NK stimulate cu BioBran MGN 3 s-a materializat prin cresterea exprimarii CD69 si a CD25 de la o medie de 9% la 88%,si respectiv de la 6% la 90%(rara cresterii fiind de 3,1ori,respectiv de 3,2ori).

Acesti parametri statistici au ramas nemodificati in cazul altor receptori supusi observatiei in acest studiu. Celulele NK stimulate prin IL-15,folosite ca repere de pozitivitate, au prezentat o crestere medie a exprimarii CD25 semnificativa (de la 6% la 92%,cu raportul MFI crescut de 3,9 ori), a CD69(9%-98%,MFI ratio crescut de 35,5 ori), a NKG2D(92%-97%,MFI ratio crescut de 2,1 ori), a DNAM(81%-96%,MFI ratio crescut de 1,7 ori) si NKp30(54%-81%,MFI ratio crescut de 3,8 ori).

Tabelul I si Fig.2A si 2B prezinta raspunsul receptorilor de pe celulele NK, in curs de activare prin expunerea nocturna la BioBran MGN 3 si prin stimularea cu IL-15.

Testele de citotoxicitate''in vitro''

Stimularea nocturna cu Biobran MGN 3 a produs o crestere semnificativa a citotoxicitatii celulelor NK impotriva tuturor liniilor celulare testate, intr-un raport E/T de 8:1(K562,NB1691,Jurkat,A673)sau de 10:1(A-204,RD,RH-30),in comparatie cu celulele NK aflate in repaus(Fig.3A,K562 80%vs.69%,P=0,03;NB1691 41%vs.23%,P=0,003;Jurkat 40%vs.19%,P=0,03;A673 34%vs.13%,P=0,02;A204 34%vs.18%,P=0,03;RD 45%vs 22%,P=0,02;RH-30 34%vs18%,P=0,02). Stimularea prin IL-15 a dus chiar la procente mai mari de liza a celulelor K562 (100%),NB1691(61%), Jurkat(60%)si A673(58%)(Fig.3B).

Pentru a testa efectul sinergic al IL-2si BioBran MGN 3,s-au comparat stimularea cu doze mari de IL-2(1000 UI/ml) cu stimularea prin doze mici de IL-2(40UI/ml)si cu doze mici de IL-2plus BioBran MGN 3.

Adaugarea de BioBran MGN 3 la dozele mici de IL-2 a avut ca rezultat intensificarea efectului stimulator in cazul dozelor de 40UI/ml deIL-2,adica efect citotoxic comparabil celui obtinut la dozele de 1000UI/ml de IL-2(Fig.3C). In vederea testarii aspectului legat de siguranta utilizarii celulelor NK stimulate cu BioBran MGN 3, s-au efectuat testari asupra esantioanelor de celule autologe negative in privinta CD56,rezultand absenta citotoxicitatii acestei populatii celulare(Fig.2 si Tab.1,suplimentare).

Modelul''in vivo''

Pentru a examina daca efectul stimulativ al BioBran MGN 3 asupra celulelor NK''in vitro''are semnificatie clinica,studiul a extins investigatiile asupra unui model de heterogrefa(''in vivo'')de neuroblastom,supus transductiei de luciferaza in prealabil.

Fig.4 prezinta bio-imagistica in incidente dorsala si ventrala a 3 subiecti murini ce au primit doar ser tamponat(grup control), grup primind 1000000celule NK nestimulate si, in fine,grupul primind aceeasi cantitate de celule NK stimulate prin BioBran MGN 3 .S-a constatat o marcata progresie tumorala a liniei celulare NB1691 in cadrul grupului de control si in cel primind celule NK nestimulate, in timp ce, in grupul care a primit celule NK stimulate cu BioBran MGN 3 s-a constatat o incetinire statistic semnificativa a cresterii tumorale(Fig.4B si Tab.II;suplimentar).

S-a observat,deasemenea, o crestere semnificativa a supravietuirii populatiei celulare NK stimulate prin BioBran MGN 3, utilizandu-se modelul NOD/scid/IL-2Rgamma nul-hu(P<0,005;Fig.4C).

Rolul BioBran MGN 3 in cresterea populatiei de celule NK.

Dupa 2 saptamani in mediu de cultura,activitatea celulelor NK s-a intensificat mai evident cand acestuia i s-a adaugat BioBran MGN 3(Tab.IIIsupl).

Dimpotriva,inmultirea celulelor T a regresat in aceleasi conditii(Fig.5A).

Adaugarea de BioBran MGN 3 culturilor tratate cu IL-2,ca si celor tratate cu IL-2 plus IL-15 nu a produs diferente semnificative statistic in cazul celulelor NK T si B. Activitatea citotoxica a celulelor NK proliferate nu s-a modificat semnificativ in cazul adaugarii MGN-3/Biobran in mediul de cultura(Fig.5B).

In schimb,adaugarea de IL-15 a crescut citotoxicitatea in comparatie cu situatia constand in adaugare doar de IL-2, chiar in cazul liniei celulare K562(luciferazo+).

Mecanismele stimularii celulelor NK de catre BioBran MGN 3.

Intrucat celulele NK umane pot fi stimulate prin receptorii TLR,a fost testata initierea stimularii TLR prin BioBran MGN 3 utilizandu-se macrofage umane drept biosenzori, in scopul identificarii dozei optime BioBran MGN 3 care sa stimuleze celulele NK, fara a stimula si macrofagele.

Doar nivele ridicate de BioBran MGN 3(10mg/ml)au reusit eliberarea deIL-8,IL-6 si de TNF-alfa(4776;164 si,respectiv 132picograme/ml,Fig.1).

Rezultatele acestor masuratori au fost semnificativ mai scazute fata de cele observate in cazul stimularii prin LPZ,10ng/ml(7487;362si,respectiv 208pg/ml).

S-au observat urme(1,68Eu/ml) de contaminare cu LPZ a BioBran MGN 3 prin testare cu un lizat din amoebocitul limulus(LAL).

In vederea cercetarii rolului contaminarii cu LPZ a BioBran MGN 3 ca si mecanism al stimularii imune, s-au efectuat''in vitro''testari ale citotoxicitatii asupra liniei NB1691. Acestea au aratat o crestere in  activitatea citotoxica a celulelor NK stimulate de LPZ, comparativ cu celulele NK in repaus, in timp ce polimixina B a anulat efectul stimularii prin LPZ(Fig.6A).Din contra, efectul stimulativ al BioBran MGN 3 in ceea ce priveste activitatea NK indreptata impotriva NB1691 nu a putut fi antagonizat de catre polimixina B(Fig.6B).

Mecanismul stimularii NK de catre BioBran MGN 3 nu este mediat prin contaminarea cu LPZ.

DISCUTII

Articolele publicate pana in prezent au aratat ca utilizarea BioBran MGN 3 in terapia cancerului poate imbunatati rezultatele in unele cazuri de adulti cu boala canceroasa.[30,31]. Un lot clinic constituit din pacienti adulti suferind de carcinom hepatocelular a scos in evidenta faptul ca asocierea BioBran MGN 3 la terapiile interventionale,incluzand chimioembolizarea transarteriala, injectarea percutana de etanol, ablatia prin radiofrecventa ori crioablatia au imbunatatit supravietuirea generala[21]. S-a publicat si faptul ca adaugarea de BioBran MGN 3 a stimulat imunitatea inascuta a pacientilor cu mielom multiplu prin cresterea activitatii citotoxice a celulelor NK, ca si nivelele mieloide ale receptorilor DC si concentratiile citokinelor asociate celulelor T helper tip 1[32]. Nu au existat pana in prezent date privind utilizarea BioBran MGN 3 in oncologia pediatrica.

Studiul de fata arata ca stimularea celulelor NK prin BioBran MGN 3 a imbunatatit atat''in vitro''cat si''in vivo''activitatea citotoxica a acestora indreptata impotriva diverselor linii celulare tumorale infantile. Studiul a demonstrat cresterea efectului omorator al celulelor NK in cazul leucemiei acute, neuroblastomului, sarcomului Ewing, rabdomiosarcomului embrionar si rabdomiosarcomului alveolar; s-a lucrat''in vitro''pe linii celulare ale acestor tipuri tumorale, dupa stimulare cu BioBran MGN 3. Studiul a mai evidentiat o inhibare semnificativa a cresterii neuroblastomice si o imbunatatire semnificativa a supravietuirii cazurilor de neuroblastom conform modelului  NOD/scid/IL-2Rgamma null, folosind celule NK stimulate prin BioBran MGN 3.

Aceste date sunt in concordanta cu cele deja publicate in domeniul oncologiei adultului[20-25].

Mecanismul si doza prin care BioBran MGN3 creste activitatea celulelor NK raman necunoscute.Autorii sugereaza ca poate fi interesata o varietate de mecanisme imune in acest sens.Intrucat dozele mari de BioBran MGN 3 au avut ca efect modificarea macrofagelor de la M0 la M1-adica eliberare de IL-6,IL-8 si de TNF-alfa,autorii iau in calcul necesitatea unei doze mici de BioBran MGN 3 spre a evita activarea celulelor NK cauzata de existenta unui fond inflamator.

Deoarece agonistii TLR pot stimula celulele NK umane,autorii emit ipoteza conform careia contaminarea cu LPZ aMGN-3/Biobran ar putea creste citotoxicitatea celulelor NK prin antrenarea TLR-4. Studiul de fata,nivelul contaminarii cu LPZ a fost redus.Totusi,neutralizarea LPZ cu polimixina B nu a anulat efectul stimulativ al BioBran MGN 3 asupra activitatii NK, sugerand faptul ca nu contaminarea cu LPZ este mecanismul prin care BioBran MGN 3 stimuleaza celulele NK.In concordanta cu datele studiului de fata, Biobran MGN 3 se dovedeste activator al celulelor NK aflate in repaus,dar nu este capabil sa activeze mai departe celulele aflate in expansiune in urma IL-15,in discordanta evidenta cu dinamica acestei faze.Aceasta constatare sugereaza un mecanism suprapus partial cu IL-15. O alta teorie ia in calcul efectul  de apoptoza mediat de activarea celulelor NK, cu eliberarea consecutiva de TNF-alfa si de INF-gamma[30,33]. Aceasta teorie este sustinuta de date recent publicate care concluzioneaza ca asocierea BioBran MGN 3 cu chimioterapia a avut un efect sinergic,fiind evidentiata intensificarea apoptozei si diminuarea proliferarii celulelor tumorale din cancerul de san[34].Un alt posibil mecanism ar putea fi cresterea numarului de receptori activatori de pe celulele NK stimulate prin BioBran MGN 3. Autorii au observat o crestere a numarului de receptori activatori CD69 si CD25 la nivelul celulelor NK provenind de la donatori sanatosi,dupa stimularea acestor culturi prin BioBran MGN 3. Sporul CD69 de la nivelul NK se coreleaza cu o crestere a citotoxicitatii acestor celule[35-37]. In completare,potentialul proliferativ este indicat de cresterea exprimarii CD25 pe celulele NK[38]. In fine, s-au comunicat interactiuni ale BioBran MGN 3 si cu alte tipuri de celule imune[39,40].

Transferul de celule NK activate ''in vitro'' este folosit in mod curent in oncoterapie. Studii recente au demonstrat ca celulele NK se pot multiplica considerabil''ex vivo''folosind metode variate, incluzand utilizarea K562-mb15-41BBL drept celule hranitoare[28]. Aceste celule NK aflate in expansiune au exercitat o activitate antitumorala ''in vitro'' asupra unei varietati de linii celulare si neoplazii, incluzand cancere ale adultilor si copiilor[41-43].Cand  s-a adaugat BioBran MGN 3 pentru diverse protocoale de studiu al cresterii populatiei celulare, s-a obsevat o imbunatatire a acestui aspect in cazul celulelor NK, precum si conservarea activitatii citotoxice, totodata cu diminuarea proliferarii, in domeniul populational al celulelot T. Aceste date ar putea fi importante pentru explicarea largimii aspectelor de crestere populationala a celulelor NK inalt citotoxice cu impact clinic, in special in cazul situatiilor de allogenie,in care celulele T ar trebui sa fie indepartate pentru a evita patologia reactiilor gazda/grefa. Aditional, folosirea combinatiei dintre BioBran MGN 3 si IL-2 in doze mici a crescut activitatea citotoxica a celulelor NK la acelasi nivel ca si in cazul utilizarii doar de IL-2, in doze mari. Aceste date sunt in concordanta cu studiile mai vechi[44]. Prin urmare,BioBran MGN 3 si doze mici de IL-2 actioneaza sinergic si aceasta modalitate poate evita toxicitatea legata de utilizarea''in vivo'' a dozelor mari de IL-2 ca tratament.

Datele furnizate de studiile privitoare la pacientii adulti au sugerat ca utilizarea BioBran MGN 3 ca si tratament alternativ ori adjuvant in diverse abordari imunoterapeutice poate fi benefica tratamentului starilor maligne[20,22,24]. Rezultatele prezentului studiu extind adresabilitatea catre populatia pacientilor din pediatrie, sustinuta de cresterea activitatii citotoxice a celulelor NK prin adaugarea  BioBran MGN 3, in sfera luptei contra unei varietati de tumori infantile''in vitro'',si a neuroblastomului''in vivo''. Autorii au obsevat,deasemenea, ca adaugarea de BioBran MGN 3 a crescut expansiunea/activarea celulelor NK si, in asociere cu doze mici de IL-2, are un efect benefic de activare a celulelor NK in cazul imunoterapie indreptate impotriva neuroblastomului. Sunt necesare studii noi in domeniul pediatric pentru lamurirea rolului BioBran MGN 3 asociat protocoalelor chimi-imuno-terapeutice.

MULTUMIRI

Colectivul acestui studiu aduce multumiri Daiwa Pharmaceutical Co.Ltd.,Tokio,Japan,pentru punerea la dispozitie a MGN-3/Biobran.Aduce multumiri dr.Torres Canizales pentru sprijinul acordat in efectuarea testelor de flow-citometrie;dr.J.Diez Sebastian pentru analizele de statistica si dr.Aimee Talleur pentru corecturile in lb.engleza.

Aceasta lucrare a fost sustinuta partial de catre Serviciul National de Sanatate al Spaniei, prin aprobarea FIS PI 12/01622;de catre Fundatia Societatii Spaniole de Hemato-Oncologie Infantila si Fundatia Cancerului CRIS(http://www.criscancer.org/en/index.php); de catre Antonio Perez-Martinez; de catre Fundatia Germana a LeucemieiJose Carreras,si de catre Fundatia Germana a Cancerului Infantil(DKS)prin Matthias Pfeiffer.

CONFLICTE DE INTERESE: autorii nu au interese comerciale, de proprietate ori financiare in sfera produselor sau companiilor evocate in acest articol.